Оценка смертности, вызванной патогенными бактериями, у личинок C. elegans

Аннотация

Источник: Anderson, Q. L., et al. Высокопроизводительная система C. elegans на основе жидкой жидкости с высокой пропускной способностью. J. Vis. Exp. (2018)

В видеоролике показан анализ на жидкой основе, в котором генетически модифицированные личинки C. elegans подвергаются воздействию патогенных бактерий в микропланшете. Бактериальные токсины, выделяемые в среду, вызывают стресс и смерть хозяина. Флуоресцентный краситель окрашивает мертвых червей, позволяя количественно оценить смертность на основе визуализации для оценки генетической восприимчивости или устойчивости.

Протокол

1. Настройка анализа на жидкостное убийство (базовый протокол)

Заметка: Это протокол для одного штамма бактерий и одного источника червей.

1. С помощью скребка для клеток удалите Pseudomonas aeruginosa из планшета Slow Killing или SK и повторно суспендируйте в ~ 5 мл S базала. При необходимости увеличивайте масштаб. Измерение оптической плотности бактериальной суспензии с помощью спектрофотометра (OD₆₀₀)
2. Приготовьте 24 мл разбавленного запаса P. aeruginosa в S базальном растворе наружным диаметром₆₀₀ ≈ 0,09 (конечная концентрация 3X). Смотрите 4.6.2 для конечного содержания на лунку и соответственно масштабируйте объем бактериального разведения.
3. Добавьте 21 мл жидкой среды Slow Kill (3 г NaCl, 3,5 г пептона/л с добавлением CaCl₂ и MgSO₄ до конечной концентрации 1 мМ). С помощью многоканальной пипетки перенесите 45 μл бактерий и среды в каждую лунку 384-луночного планшета.
4. Промойте червей из их источника в коническую трубку объемом 50 мл и дайте червям осесть под действием силы тяжести. Асасируйте надосадочную жидкость до 5 мл. Ресуспендировать в общей сложности 50 мл S базала.
5. Повторите шаг 1.4 дважды.
6. С помощью сортировщика червей отсортируйте примерно по 22 червя в каждую лунку 384-луночного планшета.
   Заметка: Установка сбрасывает каждого червя в ~1,1 мкл жидкости. 22 червя составят 25 μл, в результате чего общий объем анализа составит 70 μл/лунку.
   1. Конечный состав каждой лунки состоит из 70 мкл. 45 мкл этого объема добавляется в качестве бактериальной среды (0,03 OD₆₀₀ бактерий в 24 мкл S базальной, и 21 мкл SK с добавлением CaCl₂ и MgSO₄). Остальные 25 мкл добавляются вместе с 22 червями.
   2. Если используемый здесь сортировщик (см. Таблицу материалов) недоступен, червей можно разбавить до конечной концентрации 1 червь/мкл в S Basal и дозировать 25 мкл/лунку с помощью многоканальной пипетки. Тем не менее, результаты могут демонстрировать повышенную вариабельность. В качестве альтернативы можно использовать перистальтический дозатор жидкости, как описано Леунгом и его коллегами.
7. После того, как черви были отсортированы в 384-луночный планшет, запечатайте планшет газопроницаемой пленкой и инкубируйте планшеты при температуре 25 °C в течение 24 - 48 часов.
8. В нужное время используйте мойку для микропланшетов, чтобы промыть пластину на 384 лунки с S Basal в общей сложности 5 раз.
   1. После второй промывки отасуньте большую часть среды, оставив ~20 μл. Энергично встряхните пластины с помощью микропланшетного вортексера в течение не менее 30 секунд, чтобы удалить любой мусор со дна лунок).
9. После окончательной промывки аспирируйте надосадочную жидкость до 20 μл. Добавьте 50 μЛ 0,98 μМ красителя для нуклеиновых кислот (см. Таблицу материалов) в лунку 384-луночного планшета, чтобы конечная концентрация составила 0,7 μМ.
10. Выдерживать при комнатной температуре в течение 12 - 16 ч. Этот краситель только испачкает мертвых червей. По истечении желаемого периода инкубации вымойте пластины с помощью шайбы для микропланшетов, чтобы удалить излишки пятен (минимум 3 стирки).
11. Для получения данных используйте спектрофотометр или автоматический микроскоп для получения изображений как проходящего света, так и флуоресценции (возбуждение 531 нм и излучение 593 нм).

Материалы