Оценка смертности, вызванной патогенными бактериями, у личинок C. elegans

Аннотация

Источник: Anderson, Q. L., et al. Высокопроизводительная система C. elegans на основе жидкой жидкости с высокой пропускной способностью. J. Vis. Exp. (2018)

В видеоролике показан анализ на жидкой основе, в котором генетически модифицированные личинки C. elegans подвергаются воздействию патогенных бактерий в микропланшете. Бактериальные токсины, выделяемые в среду, вызывают стресс и смерть хозяина. Флуоресцентный краситель окрашивает мертвых червей, позволяя количественно оценить смертность на основе визуализации для оценки генетической восприимчивости или устойчивости.

Протокол

1. Настройка анализа на жидкостное убийство (базовый протокол)

Заметка: Это протокол для одного штамма бактерий и одного источника червей.

1. С помощью скребка для клеток удалите Pseudomonas aeruginosa из планшета Slow Killing или SK и повторно суспендируйте в ~ 5 мл S базала. При необходимости увеличивайте масштаб. Измерение оптической плотности бактериальной суспензии с помощью спектрофотометра (OD₆₀₀)
2. Приготовьте 24 мл разбавленного запаса P. aeruginosa в S базальном растворе наружным диаметром₆₀₀ ≈ 0,09 (конечная концентрация 3X). Смотрите 4.6.2 для конечного содержания на лунку и соответственно масштабируйте объем бактериального разведения.
3. Добавьте 21 мл жидкой среды Slow Kill (3 г NaCl, 3,5 г пептона/л с добавлением CaCl₂ и MgSO₄ до конечной концентрации 1 мМ). С помощью многоканальной пипетки перенесите 45 μл бактерий и среды в каждую лунку 384-луночного планшета.
4. Промойте червей из их источника в коническую трубку объемом 50 мл и дайте червям осесть под действием силы тяжести. Асасируйте надосадочную жидкость до 5 мл. Ресуспендировать в общей сложности 50 мл S базала.
5. Повторите шаг 1.4 дважды.
6. С помощью сортировщика червей отсортируйте примерно по 22 червя в каждую лунку 384-луночного планшета.
   Заметка: Установка сбрасывает каждого червя в ~1,1 мкл жидкости. 22 червя составят 25 μл, в результате чего общий объем анализа составит 70 μл/лунку.
   1. Конечный состав каждой лунки состоит из 70 мкл. 45 мкл этого объема добавляется в качестве бактериальной среды (0,03 OD₆₀₀ бактерий в 24 мкл S базальной, и 21 мкл SK с добавлением CaCl₂ и MgSO₄). Остальные 25 мкл добавляются вместе с 22 червями.
   2. Если используемый здесь сортировщик (см. Таблицу материалов) недоступен, червей можно разбавить до конечной концентрации 1 червь/мкл в S Basal и дозировать 25 мкл/лунку с помощью многоканальной пипетки. Тем не менее, результаты могут демонстрировать повышенную вариабельность. В качестве альтернативы можно использовать перистальтический дозатор жидкости, как описано Леунгом и его коллегами.
7. После того, как черви были отсортированы в 384-луночный планшет, запечатайте планшет газопроницаемой пленкой и инкубируйте планшеты при температуре 25 °C в течение 24 - 48 часов.
8. В нужное время используйте мойку для микропланшетов, чтобы промыть пластину на 384 лунки с S Basal в общей сложности 5 раз.
   1. После второй промывки отасуньте большую часть среды, оставив ~20 μл. Энергично встряхните пластины с помощью микропланшетного вортексера в течение не менее 30 секунд, чтобы удалить любой мусор со дна лунок).
9. После окончательной промывки аспирируйте надосадочную жидкость до 20 μл. Добавьте 50 μЛ 0,98 μМ красителя для нуклеиновых кислот (см. Таблицу материалов) в лунку 384-луночного планшета, чтобы конечная концентрация составила 0,7 μМ.
10. Выдерживать при комнатной температуре в течение 12 - 16 ч. Этот краситель только испачкает мертвых червей. По истечении желаемого периода инкубации вымойте пластины с помощью шайбы для микропланшетов, чтобы удалить излишки пятен (минимум 3 стирки).
11. Для получения данных используйте спектрофотометр или автоматический микроскоп для получения изображений как проходящего света, так и флуоресценции (возбуждение 531 нм и излучение 593 нм).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Биосортировщик COPAS FP	Union Biometrica		Проточный цитометр для больших объектов/сортировщик червей
Цитация 5	БиоТек
EL406 Диспенсер для омывателя	БиоТек
Multitron Pro	Инфорс ХТ
24 Блок RB с глубокими скважинами	Thermo Fisher Scientific	CS15124
384-луночный планшет	Greiner Bio-One	МПГ-781091
Питательная среда для нематод (NGM)			Количество на литр: 18 грамм агара, 3 грамма NaCl, 2,5 грамма пептона, 1 мл CaCl₂ (1 М), 1 мл MgSO₄ (1 М), 25 мл фосфатного буфера и 973 мл воды milli-Q
Пластины медленного убийства (SK)			Количество на литр: 18 грамм агара, 3 грамма NaCl, 3,5 грамма пептона, 1 мл CaCl₂ (1 М), 1 мл MgSO₄ (1 М), 25 мл фоспатного буфера и 973 мл воды milli-Q
Медленные убийства (SK)			Количество на литр: 3 грамма NaCl, 3,5 грамма пептона, 1 мл CaCl₂ (1 М), 1 мл MgSO₄ (1 М), 25 мл фосфатного буфера и 973 мл миллидобротной воды
Бульон лизогении (LB)	USBиология Медико-биологические науки	Л1520
Бульон Brian Heart Infusion (BHI)	Исследовательская международная корпорация «Ресерч продактс интернэшнл»	50-488-526
Раствор для отбеливания червей			Количество на 100 мл: 10 мл 5 М раствора NaOH, 20 мл 5% раствора гипохлорита натрия и 70 мл стерильной воды
S базальный			Количество на литр: 5,85 грамма NaCl, 6 грамм KH₂PO₄, 1 грамм K₂�HPO₄ и 1 литр воды milli-Q
Агар	USBиология Медико-биологические науки	А0930
NaCl	USBиология Медико-биологические науки	С5000
Пептон	USBиология Медико-биологические науки	П3300
CaCl₂	USBиология Медико-биологические науки
MgSO₄	Научный центр Фишера	М63-500
Фоспатный буфер			количество на литр: 132 мл K₂HPO₄ (1M) и 868 мл KH₂PO₄ (1M)
КХ₂PO₄	Акрос Органик	7778-77-0
К₂HPO₄	USBиология Медико-биологические науки	П5100
5% раствор гипохлорита натрия	БИККА	7495.5-32
Решение NaOH	Научный центр Фишера	СС255-1
Дышите спокойно	Диверсифицированная биотехнология	БЭМ-1
SYTOX Краситель для оранжевых нуклеиновых кислот	Научный центр Фишера	С11368
Штаммы бактерий
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis (OG1RF)
Суперфуд кишечной палочки (OP50)
Кишечная палочка Бактерии, экспрессирующие РНК-интерференцию (HT115)
Штаммы червей
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
Репортер PINK-1::GFP (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)