Культивирование и поддержание РНК-экспрессирующих бактерий

Аннотация

Источник: Андерсон, К. Л., и др., Высокопроизводительная система с высоким содержанием жидкости C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется получение РНК-интерференции (РНК-интерференции) бактерий, несущих плазмиды, для подавления экспрессии генов-мишеней. В нем описаны этапы отбора, роста и индукции бактерий РНК-интерференции для производства пластин, экспрессирующих дцРНК, для последующих анализов.

Протокол

1. Получение РНК-интерференции (РНК-интерференции) бактерий

1. Выделите или перенесите нужные штаммы РНК-интерференц-содержащих бактерий на агаровые планшеты лизогенного бульона (LB), содержащие соответствующие антибиотики (карбенициллин в концентрации 100 г/мл и тетрациклин в концентрации 15 г/мл для библиотек Ahringer и Vidal) из замороженного материала.
   Заметка: При работе с непатогенными бактериями используйте либо шкаф биологической безопасности уровня биобезопасности (BSL)-2 A/B, либо шкаф с ламинарным потоком BSL-1, чтобы обеспечить стерильность культур и свести к минимуму вероятность перекрестного загрязнения библиотеки.
2. Инкубируйте планшеты в течение 24 часов при 37 °C.
3. Храните тарелки при температуре 4 °C до двух недель.
   1. Через две недели выбросьте тарелки и замените их свежеприготовленными тарелками.
4. Тестируйте несколько штаммов РНК-интерференции параллельно, индивидуально вводя одну колонию из каждого клона в 4 мл LB, дополненного карбенициллином, в одну лунку 24-луночного глубоколуночного планшета или в стерильную пробирку.  
   Заметка: Сообщалось, что тетрациклин снижает эффективность РНК-интерференции. Не используйте его в этой среде.
5. Поместите 24-луночные планшеты глубокого лунки в встряхивающий инкубатор, оптимизированный для многолуночных планшетов, и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 16 часов, встряхивая при 950 об/мин. Заметка: Добиться равномерного роста бактерий в многолуночных планшетах с помощью обычного встряхивающего инкубатора сложно. Встряхивающий инкубатор должен иметь возможность встряхивать со скоростью не менее 750 об/мин, чтобы культуры росли должным образом. При отсутствии специализированного шейкера есть возможность выращивать каждую культуру в отдельной трубе. Культуры могут быть перенесены в 24-луночный планшет для последующего центрифугирования.
6. Соберите бактерии путем центрифугирования в течение 5 минут при концентрации 2 000 x g.
7. Сцедите надосадочную жидкость, перевернув тарелку и энергично встряхнув. Ресуспендируют РНК-интерференционные бактерии в 100 мкл S базала (5,85 г натрия хлорида, NaCl; 1 г дикалийфосфата, K₂HPO₄; 6 г монокалийфосфата, KH₂PO₄ растворить в 1 л сверхчистой воды и стерилизовать автоклавом).
8. Пипеткой ресуспендировали бактерии в соответствующее количество лунок многолуночного планшета NGM (нематода питательной среды, 3 г NaCl, 2,5 г пептона, 1 мМ кальция хлорида, CaCl₂; 1 мМ сульфата магния, MgSO₄; 25 мл фосфатного буфера (количество на литр: 132 мл K₂HPO₄ (1 M) и 868 мл KH₂PO₄ (1M)), и 18 г агара на литр воды) с добавлением IPTG (изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид; 1 мМ конечная концентрация) и карбенициллина (100 мкг/мл конечной концентрации).
   1. Используйте 3,5 мл среды NGM на лунку 6-луночного планшета, 1 мл на лунку 24-луночного планшета или 150 мкл на лунку 96-луночного планшета.
   2. Используйте 100 μл/лунку бактерий для 6-луночного планшета, 50 μл/лунку для 24-луночного планшета или 20 μл/лунку для 96-луночного планшета. Дайте высохнуть.
      Заметка: Сушка обычно выполняется в стерильном вытяжном шкафу для обеспечения быстрой и равномерной сушки. Очень важна равномерная сушка. Не допускайте пересушивания, так как трещины на агаре способствуют закапыванию червей. Это приводит к потерям от червей и потенциальному засорению систем работы с жидкостями.
9. Готовые пластины используйте сразу или храните при температуре 4 °C до двух недель для последующего использования.
   Заметка: Чтобы пластины не пересыхали, их можно запечатать пластиковой парафиновой пленкой или поместить в плотно закрытую емкость с влажными бумажными полотенцами.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
24 глубокоскважинный блок RB	Thermo Fisher Scientific	CS15124
Нематода Питательная среда (НГМ)			Количество на литр: 18 грамм агара, 3 грамма хлорида натрия, 2,5 грамма пептона, 1 мл хлорида кальция (1 М), 1 мл сульфата магния (1 М), 25 мл фосфатного буфера и 973 мл миллидобротной воды
Бульон лизогении (LB)	USBиология Медико-биологические науки	Л1520
S базальный			Количество на литр: 5,85 грамма хлорида натрия, 6 грамм монокалийфосфата, 1 грамм дикалийфосфата и 1 литр воды milli-Q
Агар	USBиология Медико-биологические науки	А0930
Хлорид натрия	USBиология Медико-биологические науки	С5000
Пептон	USBиология Медико-биологические науки	П3300
Хлорид кальция	USBиология Медико-биологические науки
Сульфат магния	Научный центр Фишера	М63-500
Фоспатный буфер			Количество на литр: 132 мл дикалийфосфата (1 М) и 868 мл монокалийфосфата (1 М)
Монокалийфосфат	Акрос Органик	7778-77-0
Дикалийфосфат	USBиология Медико-биологические науки	П5100