Экспрессия люминесцентного оперона у морских биолюминесцентных бактерий

Аннотация

Источник: Brodl, E., et al. На месте Измерение и корреляция плотности клеток и светового излучения биолюминесцентных бактерий. J. Vis. Exp. 1 (2018)

В этом видео демонстрируется культивирование морских биолюминесцентных бактерий для наблюдения за активацией люминесцентного оперона, опосредованной чувством кворума, что позволяет в режиме реального времени отслеживать экспрессию генов и световое излучение для исследований микробной коммуникации и регуляции генов.

Протокол

1. Экспрессия бактериальных биолюминесцентных штаммов

ЗАМЕТКА: Бактериальным биолюминесцентным штаммам требуется специальная питательная среда/искусственная среда морской воды для роста и производства света.

1. Приготовьте искусственную морскую водную среду, состоящую из двух отдельно приготовленных компонентов среды.
   ЗАМЕТКА: Следующие количества указаны для 1 л жидкой среды или 1 л агаровой среды.
   1. Для искусственной морской водной среды необходимо принять следующие соли: 28,13 г NaCl (хлорид натрия), 0,77 г KCl (хлорид калия), 1,60 г CaCl₂ · 2H₂O (дигидрат хлорида кальция), 4,80 г MgCl₂ · 6H₂O (гексагидрат хлорида магния), 0,11 г NaHCO₃ (бикарбонат натрия) и 3,50 г MgSO₄ · 7H₂O (гептагидрат сульфата магния).
   2. Добавьте 1 л дистиллированной воды и растворите все компоненты.
   3. Для среды LB (Лурия-Бертани) взвесьте следующие ингредиенты: 10 г дрожжевого экстракта, 10 г пептона, а для агаровых пластин еще 20 г агара.
   4. Добавьте 250 мл водопроводной воды и растворите компоненты.
   5. Автоклав обе подготовленные среды отдельно при температуре 121 °C в течение 20 мин.
   6. Для агаровых пластин смешайте 250 мл среды LB с 750 мл искусственной среды морской воды сразу после автоклавирования и подготовьте пластины.
   7. Для жидкой среды смешайте 250 мл LB среды с 750 мл искусственной морской среды непосредственно после автоклавирования или после охлаждения.
      ЗАМЕТКА: Искусственная морская водная среда может мутнеть из-за осаждения соли.
2. Нанесите бактериальные биолюминесцентные штаммы на агаровые пластины искусственной морской воды и инкубируйте в течение ночи при температуре 24 - 30 °C.
   ЗАМЕТКА: Длительное хранение штаммов бактерий обычно достигается за счет замораживания запасов глицерина бактериальной культуры. Штаммы всегда следует наносить сначала на агаровые пластины, чтобы обеспечить одинаковые начальные условия для всех штаммов, прежде чем использовать их для жидких культур, из-за фазы задержки в росте после оттаивания.
3. Приготовьте ONC (ночную культуру) путем инокуляции 100 мл искусственной морской водной среды одной колонией из планшета. Инкубируйте ONC при температуре 24 - 30 °C и 120 об/мин в шейкере инкубатора в течение ночи.
4. Инокулируйте 800 мл искусственной морской водной среды 8 мл ONC.
5. Инкубируйте бактериальные клетки при температуре 24 - 30 °C и 120 об/мин в шейкере инкубатора.
   ЗАМЕТКА: Профиль интенсивности света биолюминесцентных бактерий сильно изменяется в зависимости от температуры. В зависимости от регуляторных механизмов светопродукции соответствующего бактериального штамма, световое излучение может начаться примерно через 1 - 6 часов.
6. Наблюдайте за культурой бактериальных клеток до тех пор, пока они не начнут сиять (примерно 1 - 6 ч).
   ЗАМЕТКА: В зависимости от цели экспрессии, клетки выращивают до следующего дня, а затем собирают, или же клетки могут встряхиваться до тех пор, пока они сияют. Забор клеток и очистка любых белков может производиться в соответствии со стандартными процедурами.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стандартный шейкер инкубатора Multitron	Инфорс АГ