Микроскопический анализ роста бактерий под воздействием стресса с использованием микрофлюидных камер

Аннотация

Источник: Cayron, J., et al. Многомасштабный анализ роста бактерий при стрессовой терапии. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео показано, как подготовить и использовать микрофлюидную пластину для визуализации бактериальных клеток в условиях стресса. В нем описан процесс введения бактериальной культуры и стресс-индуцированной антибиотической среды, за которой следует загрузка клеток и микроскопическая установка. Затем используется покадровая визуализация в фазово-контрастном режиме для наблюдения за развитием удлиненных нитевидных клеток с повышенным содержанием ДНК из-за ингибированного деления клеток.

Протокол

1. Микрофлюидная покадровая микроскопия
   1. Удалите консервирующий раствор из микрофлюидной пластины и замените его свежей средой, предварительно нагретой до 37 °C, как описано в руководстве пользователя микрофлюидного программного обеспечения.
   2. Прикрепите микрофлюидную пластину к системе коллектора и нажмите кнопку «Заливка».
   3. Поместите микрофлюидную пластину с системой коллектора на предметный столик микроскопа и предварительно нагрейте до 37 °C в течение ~2 часов перед началом микроскопии.
      ЗАМЕТКА: Этот этап предварительного нагрева имеет решающее значение для предотвращения расширения микрофлюидной камеры, которое может изменить фокусировку микроскопа во время эксперимента с интервальной съемкой и поставить под угрозу получение изображения.
   4. Закройте микрофлюидную пластину. Замените среду из лунки 8 на 150 мкл образца культуры и замените среду из лунки 1 до 5 на нужную среду с реагентом, вызывающим напряжение, или без него.
   5. Запечатайте микрофлюидную пластину и поместите ее на предметный столик микроскопа.
   6. На микрофлюидном программном обеспечении запустите процедуру загрузки клеток. Убедитесь, что нагрузка на элементы удовлетворительна, посмотрев под микроскоп в проходящем свете. Запустите процедуру загрузки ячеек второй раз, если плотность ячеек в камере недостаточна.
   7. Выполняйте тщательную фокусировку в режиме проходящего света и выберите несколько полей зрения, в которых отображаются изолированные бактерии. Важно выбирать поля, которые не переполнены, чтобы иметь возможность отслеживать рост изолированных клеток с течением времени (рекомендуется ~10–20 клеток на 100 мкм²). Это также облегчит обнаружение клеток во время анализа изображений.
   8. В программном обеспечении для микрофлюидики нажмите кнопку «Создать протокол». Запрограммируйте инъекцию питательной среды на эквивалент времени 1–2 поколения, чтобы позволить клеткам адаптироваться (опционально). Затем запрограммируйте впрыск среды, вызывающей напряжение, в течение 10 минут при давлении 2 фунта на квадратный дюйм, а затем впрыск при давлении 1 фунт на квадратный дюйм в течение желаемой продолжительности обработки напряжения. Если вы намерены проанализировать восстановление клеток после стресса, запрограммируйте инъекцию свежей питательной среды на желаемую продолжительность.
      ЗАМЕТКА: В представленном здесь эксперименте цефалексин вводили в течение 10 минут при давлении 2 фунта на квадратный дюйм, а затем в течение 50 минут при давлении 1 фунт на квадратный дюйм. Затем вводили свежую питательную среду при давлении 2 фунта на квадратный дюйм в течение 10 минут, а затем через 3 часа при давлении 1 фунт на квадратный дюйм.
   9. Выполняйте микроскопию в режиме покадровой съемки с 1 кадром каждые 10 минут с использованием фазового контраста в проходящем свете и возбуждающего источника света 560 нм для сигнала mCherry, если это необходимо.
      ЗАМЕТКА: Важно начать получение микроскопического изображения одновременно с началом протокола микрофлюидной инъекции.

Материалы