Оценка роения бактерий с помощью пластины с ингибитором градиента

Аннотация

Источник: Guo, S., et al. Количественная оценка подвижности роения бактериальной поверхности на индукторных градиентных пластинах. J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео демонстрируется использование двухслойной градиентной роевой пластины для изучения поведения бактериального роения при различных концентрациях ингибиторов. Пластину с градиентобразующим ингибитором в нижнем слое заражают бактериями и инкубируют. Изображения делаются через равные промежутки времени для анализа влияния концентрации ингибиторов на роение бактерий.

Протокол

1. Подготовка градиентных роевых пластин

1. Приготовление роевой среды
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовалась концентрация агара 0,7% (по массе) в роевой среде.
   1. Приготовить порошок отвара лизогенеза (ЛБ) с агаром в двух конических колбах; каждая колба содержит 2 г триптона, 2 г хлорида натрия (NaCl), 1 г дрожжевого экстракта и 1,4 г агара. Добавьте воду двойной дистилляции (ddH₂O) и перемешайте суспензию с помощью магнитной мешалки. Отрегулируйте итоговый объем до 200 мл, добавив дополнительно ddH₂O.
   2. Автоклавируйте раствор при 121 °C в течение 20 мин. Используйте воздухопроницаемую крышку или уплотнительную пленку для бутылки с вентиляционным отверстием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Агар растворяется при нагревании в автоклаве.
   3. Когда температура упадет до 65 °C, перемешайте раствор для обеспечения однородности и переложите среду в инкубатор с температурой 65 °C или водяную баню для кратковременного использования.
2. Приготовление придонного слоя роевой среды
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда нижнего слоя представляет собой смесь роевой среды и исходных растворов индукторов. Рецептура индукторовых градиентных роевых пластин приведена в таблице 1.
   1. Приготовьте 100 мМ стокового раствора ресвератрола, растворив 114,12 мг лиофилизированного порошка ресвератрола в 5 мл диметилсульфоксида (ДМСО), и храните раствор при температуре -20 °C.
   2. Приготовьте 20% (по массе) стоковый раствор арабинозы, растворив 6 г порошка арабинозы в 30 мл ddH₂O; подождите 10-15 минут, чтобы арабиноза растворилась; и хранить раствор при комнатной температуре.
   3. Достаньте среду из инкубатора с температурой 65 °C и поместите ее при комнатной температуре; дайте роевой среде остыть, пока колба Эрленмейера не остынет настолько, чтобы ее можно было держать (~50 °C). Не ставьте роевую среду при комнатной температуре на длительное время, так как это приведет к застыванию агара.
   4. Добавьте необходимый объем исходного раствора индуктора в роевую среду при температуре 50 °C (табл. 1). Используйте пипетку для дозирования раствора индуктора вместо того, чтобы выливать его. Осторожно перемешайте, чтобы смешать индуктор с роевой средой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предназначен для индукторов, которые не могут быть автоклавированы. Будьте осторожны, чтобы не вводить в среду пузырьки.
3. Подготовка двухслойных градиентных роевых пластин
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда верхнего слоя представляет собой среду LB, содержащую 0,7% (по массе) агара.
   1. Пометьте квадратные чашки Петри размером 13 x 13 см с названием индуктора и штаммами и подперейте чашки вверх по краю крышек (рис. 1B).
   2. Добавьте 40 мл теплой среды нижнего слоя (50 °C) с помощью пипетки объемом 50 мл или центрифужной пробирки объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, для квадратных чашек Петри размером 13 х 13 см подходит нижний слой 40 мл и верхний слой; для квадратных чашек Петри 10 х 10 см подойдет нижний слой 25 мл и верхний слой среднего.
   3. Дайте нижнему слою среды застыть в течение 1 часа внутри колпака с ламинарным потоком. Не тревожьте квадратные чашки Петри, пока среда застынет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При отверждении нижнего слоя роевая среда, не содержащая индукторов, должна содержаться в инкубаторе или на водяной бане при температуре 65 °C.
   4. Как только нижний слой полностью застынет, снимите крышки и поместите квадратные чашки Петри внутрь вытяжки с ламинарным потоком.
   5. Добавьте 40 мл теплой среды верхнего слоя (50 °C) с помощью пипетки объемом 50 мл или центрифужной пробирки объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда верхнего слоя не содержит индукторов.
   6. Отверждите двухслойные пластины на столе, накрытые и нетронутые в течение 1 часа. Храните подготовленные пластины при температуре 4 °C до 24 ч. ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время отверждения снизит содержание влаги и ограничит подвижность роения.

2. Рост E. coli K12 и P. aeruginosa PAO1

1. Приготовьте 500 мл LB среды, добавив 5 г триптона, 5 г NaCl и 2,5 г дрожжевого экстракта в ddH₂O, и долейте раствор до 500 мл. Автоклавируйте раствор в жидкостном цикле в течение 20 минут при температуре 121 °C и храните его при температуре 4 °C.
2. Приготовьте 100 мл 1,5% (масс./об.) среды LB-агара, добавив 1 г триптона, 1 г NaCl, 0,5 г дрожжевого экстракта и 1,5 г агара в ddH₂O и долейте раствор до 100 мл. Автоклавируйте раствор в жидком цикле в течение 20 мин при 121 °C. Перенесите среду на водяную баню при температуре 50 °C, чтобы предотвратить затвердевание агара.
3. Когда колбу со средой LB-агар удобно держать, добавьте 20 мл среды LB-агар в чашку Петри (диаметром 10 см) с помощью пипетки объемом 25 мл. Оставьте пластину при комнатной температуре на ночь, а тарелку для LB-агара храните при температуре 4 °C.
4. Возьмем исходные культуры, хранящиеся при -80 °С, штаммы E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 и P. aeruginosa PAO1-YdeH на чашках Петри LB-агар с использованием одноразовых петель посева. Инкубируйте перевернутые чашки Петри в течение ночи при температуре 37 °C.
5. Выберите отдельные колонии для различных штаммов из чашек Петри, инокулируйте каждую колонию в 5 мл LB-среды и инкубируйте культуру при 37 °C в лабораторном орбитальном шейкере, установленном на 220 об/мин.
6. Когда плотность культуры достигнет наружного диаметра 600 нм ~ 1,0, выньте культуру из шейкера и поместите ее при комнатной температуре. Отрегулируйте плотность культуры на OD600nm = 1.0, как описано в шаге 3.2.1.

3. Инокуляция и инкубация градиентных роевых планшетов

1. Подготовка посевных лунок
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо метода, описанного ниже, можно использовать модели крышек для 3D-печати, способные образовывать скважины, разделенные стандартным расстоянием.
   1. Отметьте положение лунок на бумаге формата А4, как показано на рисунке 1C. Установите три тестовые концентрации в одну квадратную чашку Петри с двумя или тремя повторами.
   2. Поместите помеченную бумагу формата А4 под застывшую градиентную пластину. Вставьте более широкую сторону наконечника для дозатора объемом 100 мкл в полутвердую среднюю поверхность в отмеченном месте. Нажмите на наконечник пипетки до тех пор, пока он не достигнет дна верхнего слоя среды.
   3. Когда кончик касается дна, не прикладывайте к нему вертикальной силы; Аккуратно вращайте кончик, чтобы изолировать содержимое цилиндрической лунки.
   4. Горизонтально переместите наконечники пипеток на очень небольшое расстояние, чтобы обеспечить приток воздуха в узкое пространство, отведенное в сторону. Нажмите на наконечник указательным пальцем, чтобы перекрыть поток газа внутри наконечника, удерживая пипетку большим и средним пальцами.
   5. Вытяните наконечник вертикально, сохраняя содержимое лунки в наконечнике во время его вытягивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если содержимое лунки соскальзывает, приложите немного больше давления указательным пальцем, чтобы полностью запечатать наконечник.
   6. Повторите шаги с 3.1.2 по 3.1.5 в каждой отмеченной позиции. Перед прививкой накройте роевую пластину.
2. Градиентная планшетная инокуляция и инкубация
   1. Отрегулируйте плотность роста культуры за ночь до OD600nm = 1.0.
   2. Пипеткой внесите 80 μл культуры ночного роста в каждую лунку. Не разливайте бактериальную культуру за пределы лунок.
   3. Оберните пластины герметизирующей пленкой. Для длительного наблюдения (3-5 дней) оберните пластины стерильной лабораторной резиновой лентой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Резиновая лента с меньшей вероятностью порвется.
   4. Поместите в инкубатор стакан, наполненный ddH₂O, чтобы поддерживать влажность внутри инкубатора. Инкубируйте пластины градиентного роя при температуре 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не инкубируйте роевые пластины вверх ногами; Это приведет к утечке бактериальной культуры из лунок.
   5. Визуализируйте роевую пластину сразу после инокуляции, записав это как временную точку 0 часов.

4. Визуализация роения бактериальной поверхности

1. Вынимайте роевые пластины по одной из инкубатора каждые 12 часов, держа пластину горизонтально, и помещайте их в систему визуализации геля (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте отпечатков пальцев на поверхности пластин; Держите боковую сторону роевой пластины в чистых перчатках.
2. Выбор режима визуализации геля ; подвергать пластину роя воздействию белого света; и отрегулируйте фокусное расстояние, чтобы обеспечить наиболее четкое изображение роев.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одно и то же фокусное расстояние для всех пластин в данной партии.
3. Увеличьте яркость роев для четкого наблюдения, отрегулировав время экспозиции до 300 мс. Отрегулируйте порог , чтобы свести к минимуму помехи от фонового света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Порог регулируется на рабочем интерфейсе системы визуализации геля. Увеличьте значения слева, чтобы свести к минимуму помехи от фонового света; Уменьшите значения справа, чтобы увеличить яркость роев. В этом протоколе регион обычно составляет от 6 000 до 50 000 человек.
4. Сохраните файл изображения для дальнейшего анализа. Запишите время визуализации, тип индуктора, ориентацию градиента и деформацию в файл .txt .

 

Таблица 1: Двухслойные роевые средние характеристики.

Верхний слой средний/лизогенный отвар среды (на 100 мл)
Триптон: 1 г
Хлорид натрия: 1 г
Экстракт дрожжей: 0,5 г
Агар: 0,7 г
Среда нижнего слоя/Среда, содержащая индуктор (на 100 мл)
Триптон: 1 г	Рабочая концентрация:	Концентрация исходного раствора:
Хлорид натрия: 1 г
Экстракт дрожжей: 0,5 г	- Ресвератрол: 400 мкМ	- Ресвератрол: 100 мМ
Агар: 0,7 г
Индуктор:	- Арабиноза: 0,5% (по объему)	- Арабиноза: 20% (по объему)
- Исходный раствор ресвератрола: 400 мкл	или 1% (по сравнению с объемом)
- Стоковый раствор арабинозы: 2,5 мл или 5 мл

Результаты

Рисунок 1: Схема подготовки роевой пластины с градиентом индуктора, инокуляции и инкубации. (A) Ночной рост бактериальной культуры при 37 °C. (B) Рабочий процесс двухслойного индуктора градиентной роевой пластины. i) Подперейте квадратные ча...

Материалы