Колориметрическое обнаружение деградации коры головного мозга при прорастании бактериальных спор

Аннотация

Источник: Francis, M. B., et al. Обнаружение фрагментов коры головного мозга при проращивании бактериальных спор. J. Vis. Exp. (2016).

В этом видео демонстрируется колориметрический метод обнаружения деградации коры головного мозга во время прорастания бактериальных спор путем измерения высвобождения редуцирующих сахаров с течением времени. Используя стандарты N-ацетилглюкозамина и временные пробы, анализ количественно определяет концентрацию сахара с помощью фиолетовой хромогенной реакции, указывая на степень гидролиза коры.

Протокол

1. Цветной реагент

1. Пока образцы находятся на льду, приготовьте цветной реактив. Растворите 0,320 г-диметиламинобензальдегида (DMAB; реактив Эрлиха) в 1,9 мл ледяной уксусной кислоты.
   Заметка: Реагент чувствителен ко времени, температуре и свету и не должен производиться заранее.
2. После того как DMAB полностью растворится, добавьте 100 мкл 10 Н HCl и вортекс.
3. Добавьте 5 мл ледяной уксусной кислоты и вортекс.

2. Колориметрическая реакция

1. Переложите по 100 мкл каждого охлажденного образца коры головного мозга в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
2. Добавьте в каждый образец по 700 μл свежеприготовленного цветового раствора.
3. Немедленно перенесите образцы на водяную баню при температуре 37 °C и инкубируйте РОВНО 20 минут.
4. Перелейте 200 мкл каждого образца в прозрачный 96-луночный планшет.
5. Количественное определение образцов при длине волны 585 нм на планшетном риддере. Образцы должны начинаться с желтого цвета, а положительная реакция сместится на фиолетовый. Чем больше присутствует кора, тем глубже фиолетовый цвет.

Материалы