Производство рекомбинантного белка и восстановление из везикул, полученных из бактерий

Аннотация

Источник: Streather, B.R., et al. Оптимизированное производство и анализ рекомбинантных белковых везикул из кишечной палочки. J. Vis. Exp. (2023)

В этом видео демонстрируется производство и выделение рекомбинантных белков, меченных везикулярным нуклеативным пептидом (VNp), из бактериальных везикул. Индуктор запускает экспрессию белка, меченного VNp, стимулируя образование везикул и инкапсуляцию, с последующим центрифугированием и ультразвуком для эффективного восстановления белка без лизиса клеток

Протокол

1. Бактериальная клеточная культура и индукция белка

1. Чтобы индуцировать экспрессию рекомбинантного белка из промотора Т7, добавьте изопропил-β-D-1-тиогалактопиранизид (IPTG) до конечной концентрации до 20 мкг/мл (84 мкМ). Индукция экспрессии рекомбинантного белка должна происходить в поздней логарифмической фазе (т.е. при типичной оптической плотности, OD₆₀₀ 0,8-1,0) для образования везикул. ​
   ЗАМЕТКА: Продолжительность периода индукции может различаться в зависимости от белка, при этом некоторые из них достигают максимальной продукции в течение 4 часов, а другие — в течение ночи (18 часов). На сегодняшний день максимальный вылет везикул был получен в ночных культурах.

2. Выделение рекомбинантных везикул

1. Гранулируйте клетки центрифугированием при 3 000 x g (4 °C) в течение 20 минут.
2. Чтобы стерилизовать фильтрующие, содержащие везикулы, для длительного хранения, пропустите очищенные питательные среды через стерильный фильтр из полиэфирсульфонов (PES) размером 0,45 мкм, не требующий моющих средств.
   ЗАМЕТКА: Чтобы проверить выделение жизнеспособных клеток из везикулсодержащего фильтрата, нанесите на лизогенный бульон (LB) агар и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
3. Чтобы концентрировать везикулы в меньшем объеме, пропустите стерильную среду, содержащую везикулы, через стерильный фильтр из смешанных эфиров целлюлозы (MCE) размером 0,1 мкм, не требующий моющих средств.
4. Аккуратно промойте мембрану 0,5-1 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) с помощью клеточного скребка или пластикового разбрасывателя, чтобы аккуратно удалить везикулы с мембраны. Переложите в свежую микрофуговую пробирку. ​
   ЗАМЕТКА: Очищенные везикулы можно хранить в стерильных средах или PBS при температуре 4 °C. Есть примеры рекомбинантных белков, хранящихся в этих везикулах в течение 6 месяцев, таким образом, без потери ферментативной активности.

3. Высвобождение растворимого белка из изолированных везикул

1. После того, как содержащие белок везикулы были выделены в стерильную среду/буфер, подвергнуть везикулярные липидные мембраны ультразвуковой обработке с использованием соответствующего графика для устройства (например, 6 циклов включения и выключения по 20 с) и центрифугировать при 39 000 x g (4 °C) в течение 20 минут для удаления остатков везикул. ЗАМЕТКА: Осмотический шок или моющее средство могут быть использованы в качестве альтернативы для вскрытия везикул, но необходимо учитывать влияние на функциональность белка и/или последующее применение.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG)	Мелфорд	367-93-1
Лизогенный бульон (LB) / LB агар	Лабораторные запасы	NA	10 г/л триптона; 10 г/л NaCl; 5 г/л дрожжевого экстракта (1,5 г/л агара)
MF-Millipore Мембранный фильтр (0,1 мкм, MCE)	Мерк	VCWP04700
Мембранный фильтр Millipore Express PLUS (0,45 мкм, PES)	Мерк	HPWP04700
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Лабораторные запасы	NA