Перенос плазмид F и двойной выбор антибиотиков у E. coli

Аннотация

Источник: Эрдоган, Ф., и др., Конъюгативные брачные анализы для последовательно-специфического анализа транспортных белков, участвующих в бактериальной конъюгации. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео показана процедура переноса F-плазмиды от донорских к реципиентным клеткам E. coli с использованием спасательной плазмиды и выбора трансконъюгантов с помощью двойной устойчивости к антибиотикам. Процесс включает в себя смешивание бактериальных культур, инкубацию без встряхивания, разрушение спаривающихся пар и нанесение покрытия на селективные среды для подтверждения успешного переноса плазмид.

Протокол

1. Конъюгативный брачный анализ от доноров XK1200 до реципиентов MC4100

1. Приготовьте культуру O/N клеток гена XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184 в 20 мл стерильного бульона Lysogeny (LB) с 20 мкг/мл хлорамфеникола (Cm), 50 мкг/мл канамицина (Km) и клеток MC4100 в 5 мл LB с 50 мкг/мл стрептомицина (Sm) с использованием клеток из глицеринового бульона или одной колонии на агаровой пластине и стерильной пипетке или петле. Выращивайте культуры при температуре 37 °C с встряхиванием 200 об/мин.
2. Делайте разведения 1:70 из каждой О/N культуры отдельно в 2 мл стерильного ЛБ с теми же антибиотиками. Добавьте глюкозу до конечной концентрации 100 мМ ко всем донорским клеткам. Выращивайте клетки до среднелогической фазы (наружный диаметр₆₀₀ 0,5-0,7) при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин.
3. Центрифугируйте (4 000 x g в течение 5 минут при 4 °C) для гранулирования клеток, выбросьте надосадочную жидкость, промойте один раз холодной стерильной жидкостью для удаления антибиотиков и повторно суспендируйте клетки в 2 мл холодной стерильной жидкости.
4. В двух экземплярах добавьте 100 мкл каждой культуры в 800 мкл стерильной среды LB и дайте им спариваться при 37 °C в течение 1 ч без встряхивания.
5. Поместите клетки на вихрь на 30 с, чтобы нарушить спаривание, и поместите их на лед на 10 минут, чтобы предотвратить дальнейшее спаривание.
6. Используя вихревую смесь и свежий стерильный ЛБ, приготовьте 6 разведений (от ^10-2 до ^10-7) трансконъюгантов. Выберите трансконъюгантные клетки MC4100 pOX38-Tc Δgene::Cm путем выделения 10 мкл аликвот каждого разведения на каждой половине агаровых пластин, содержащих 50 мкг/мл Sm и 20 мкг/мл Cm, как показано на рисунке 1. Повторите для обеих повторяющихся смесей. Держите область стерильной и работайте рядом с огнем. Инкубируйте планшеты O/N при 37 °C.

Результаты

Рисунок 1: Брачный анализ для оценки функции целевого гена в конъюгации. Донором и реципиентом служили клетки E. coli XK1200 pOX38-Tc ΔtraF::Cm, трансформированные pK184-TraF и MC4100 соответственно. Полученные...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Чашки Петри	Научный центр Фишера	FB0875713
Антибиотики			Окончательные концентрации
Левомицетин (см)	Научный центр Фишера	БП904-100	20 мкг/мл
Канамицин (км)	БиоБейсик Инк.	БД0286	50 мкг/мл
Стрептомицин (Sm)	Научный центр Фишера	БП910-50	50 мкг/мл