Инактивация бактерий с помощью активируемого светом флавинмононуклеотида

Аннотация

Источник: Cheng, C., et al. Инактивация патогенов посредством фотолиза рибофлавин-5'-фосфата в видимом свете. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется метод оценки фототоксического действия флавинмононуклеотида (ФМН) на патогенные бактерии. Бактериальные культуры подвергаются воздействию возрастающих концентраций ФМН и освещаются видимым светом для получения активных форм кислорода (АФК), которые повреждают клеточные компоненты. Затем выжившие бактерии количественно оценивают для оценки дозозависимого снижения жизнеспособности.

Протокол

1. Жизнеспособность золотистого стафилококка (S. aureus) после фотолиза ФМН (Рисунок 1)
   1. Перенесите колонию S. aureus (BCRC 10451) из культивируемого планшета в 10 мл бульона Lysogeny, взятого в 15 мл пробирки с завинчивающейся крышкой. Культивировать в шейкере при температуре 37°C в течение 16 часов.
   2. Перенесите 0,5 мл культуры в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте стерилизованную воду в центрифужную пробирку, чтобы разбавить культуру до оптической плотности 0,5 при 600 нм (наружный диаметр₆₀₀) (~6 x 10⁷ колониеобразующая единица [КОЕ]/мл).
   3. Перелейте 0,5 мл культуры в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, центрифугируйте при 14 000 x g в течение 10 минут и сцедите надосадочную жидкость для получения клеточной гранулы.
   4. Добавьте 1 мл рибофлавин-5'-фосфата (или флавинмононуклеотида; ФМН) - буферизованный раствор (30, 60 и 120 мкМ ФМН в калий-фосфатном буфере [ПБ]) к клеточным гранулам, полученным как на стадии 1.3, и вортекс. Для контроля облучения добавьте 1 мл PB отдельно.
   5. Перенесите по 1 мл растворов жизнеспособных бактериальных клеток, содержащих 30 мкМ ФМН и ПБ в отдельности, в стеклянные пробирки и облучите их фиолетовым светом со скоростью 10 Вт/^м2 в течение 30 мин.
   6. Перенесите по 1 мл каждого из жизнеспособных растворов бактериальных клеток, содержащих 30, 60 и 120 мкМ ФМН и ПБ, в стеклянные пробирки и облучайте их синим светом со скоростью 20 Вт/^м2 в течение 120 мин. Установите еще одну стеклянную пробирку с 1 мл раствора жизнеспособных бактериальных клеток, содержащего 120 мкМ ФМН, и облучайте ее синим светом со скоростью 20 Вт/^м2 в течение 60 минут.
   7. Установите пробирки, как описано в шагах 1.5 и 1.6 , и накройте их толстой алюминиевой фольгой. Эти трубки служат в качестве темных регуляторов.
   8. Камеру облучения (а также темные регуляторы) следует хранить в холодном помещении при температуре 9 ± 1 °C в течение 30-120 минут облучения.
      ЗАМЕТКА: Нельзя игнорировать тепло, выделяемое светодиодными лампами (LED), так как светодиодные чипы, размещенные внутри чашки, могут нагревать систему фотореакции во время экспериментов по облучению. Поэтому эксперименты проводились в холодной комнате, поддерживаемой при температуре 9 ± 1 °C.
   9. После облучения перенесите 0,2 мл из каждого из реакционных растворов на пластину с агаром Лурия (ЛК). Распределите бактерии по тарелке с помощью L-образного стеклянного стержня и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 °C.
   10. Рассчитайте количество жизнеспособных пластин и скорость инактивации S. aureus после ночного роста.

ЗАМЕТКА: Скорость инактивации S. aureus рассчитывается как процентное восстановление, которое равно [1 -I/D] ×100%, где I и D обозначают, соответственно, количество КОЕ в облучаемом образце и темновом контроле. Процентное снижение определяется как отрицательное значение скорости инактивации.

Результаты

Рисунок 1: Влияние фотолиза ФМН на жизнеспособность S. aureus.Процентное снижение определяется как отрицательное значение скорости инактивации для S. aureus, обработанного (А) ФМН пр...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Синие, зеленые и красные светодиодные фонари	Vita LED Technologies Co., Тайнань, Тайвань		Постоянный ток 12 В 5050
Диметилсульфоксид	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	190186
Инфракрасный термометр	Raytek Co. Санта-Круз, Калифорния	МТ4
LB бульон	Difco Co., Нью-Джерси
L-метионин	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	1.05707
НБТ	Bio Basic, Inc. Маркхэм, Онтарио, Канада
Электропитание	China tech Co., Нью-Тайбэй, Тайвань	YP30-3-2
Рибофлавин 5'-фосфат	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	Р7774
РНКаза	New England BioLabs, Inc. Ипсвич, Массачусетс
Счетчик солнечной энергии	Tenmars Electronics Co., Тайбэй, Тайвань	ТМ-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Центр сбора и исследования биоресурсов (BCRC), Синьчжу, Тайвань	10451
УФ-ВИД оптический спектрометр	Ocean Optics, Данидин, Флорида	USB4000
УФ-ВИД спектрофотометр	Hitachi High-Tech Science Corporation, Токио, Япония	У-2900
Фиолетовый светодиод	Long-hui Electronic Co., LTD, Дунгуань, Китай