Количественная оценка инактивации бактерий, вызванной светом, путем генерации активных форм кислорода

Аннотация

Источник: Cheng, C., et al. Инактивация патогенов посредством фотолиза рибофлавин-5'-фосфата в видимом свете. J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео буферизованная реакционная смесь, содержащая L-метионин, нитросиний тетразолий (NBT) и флавинмононуклеотид (FMN), облучается фиолетовым светом для индуцирования образования активных форм кислорода (АФК). Это приводит к бактериальной инактивации и образованию спектрометрически детектируемого формазана.

Протокол

1. Обнаружение активных форм кислорода (O₂•⁻) в золотистом стафилококке

1. Подготовьте образцы золотистого стафилококка.
2. Разбавьте бактериальную плотность образцов стерилизованной водой до оптической плотности 0,5 при длине волны 600 нм (OD (оптическая плотность)₆₀₀, ~6 x 10⁶ КОЕ (колониеобразующая единица)/мл). Перенесите 0,5 мл культуры в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируйте при давлении 14 000 x g в течение 10 мин и сцеживайте надосадочную жидкость для получения клеточной гранулы.
3. Добавьте 0,1093 г L-метионина, 0,1 г NBT (хлорид нитросинего тетразолия) и 25 мл FMN (мононуклеотид флавина) (400, 240 или 120 μM) к 75 мл PB (фосфатного буфера). На каждый 1 мл применяемого реагента конечные концентрации ФМН, метионина и НБТ составляют 100 (60 или 30) × ^10-6 М, 7,3 × ^10-3 М и 1,2 × ^10-3 М соответственно.
4. Добавьте по 1 мл каждого раствора реагента (т.е. с различными концентрациями ФМН) в полученные клеточные гранулы. Облучайте растворы фиолетовым светом со скоростью 10 Вт/^м2 в течение 10 мин.
5. Центрифугируйте смесь при давлении 14 000 x g в течение 10 минут и сцедите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) для извлечения восстановленного НБТ. Обнаружение образующихся O₂•⁻ соединений по абсорбции на длине волны 560 нм.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Диметилсульфоксид	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	190186
Инфракрасный термометр	Raytek Co. Санта-Круз, Калифорния	МТ4
LB бульон	Difco Co., Нью-Джерси
L-метионин	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	1.05707
NBT (Хлорид тетразолия нитросинь)	Bio Basic, Inc. Маркхэм, Онтарио, Канада
Электропитание	China tech Co., Нью-Тайбэй, Тайвань	YP30-3-2
Рибофлавин 5'-фосфат	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	Р7774
Счетчик солнечной энергии	Tenmars Electronics Co., Тайбэй, Тайвань	ТМ-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Центр сбора и исследования биоресурсов (BCRC), Синьчжу, Тайвань	10451
УФ-ВИД оптический спектрометр	Ocean Optics, Данидин, Флорида	USB4000
УФ-ВИД спектрофотометр	Hitachi High-Tech Science Corporation, Токио, Япония	У-2900
Фиолетовый светодиод	Long-hui Electronic Co., LTD, Дунгуань, Китай