Определение антибактериальной эффективности полимерной полоски, обогащенной антибиотиками

Аннотация

Источник: Sekar, A., et al., Новый метод определения продольной антибактериальной активности материалов, выделяющих лекарственные средства. J. Vis. Exp. (2023)

В этом видео демонстрируется анализ на основе люминесценции для оценки антибактериальной эффективности полимерной полоски, загруженной антибиотиками, путем количественного определения люминесценции, вызванной АТФ, которая снижается в бактериальных культурах, подвергшихся воздействию антибиотика.

Протокол

Настройка исследования антибактериальной активности в зависимости от времени

1. Культивируйте бактерии в течение ночи в 1 мл бульона TSB (триптический соевый бульон).
2. Разведите выращенную за ночь бактериальную суспензию до 10⁵ КОЕ/мл в стерильном MHB (бульон Мюллера-Хинтона) и проверьте жизнеспособное количество бактерий с помощью люминесцентных установок перед началом эксперимента.
3. Поместите первичный СВМПЭ (сверхвысокомолекулярный полиэтилен) и наполненные лекарствами полоски СВМПЭ (3 мм x 5 мм x 10 мм) в шприц объемом 3 мл.
4. Введите MHB, содержащий 10⁵ КОЕ/мл, в шприц через прикрепленную иглу до отметки 1,5 мл, что эквивалентно 1,35 мл MHB (Рисунок 1: Шаг 1).
5. Поместите набор шприцев в встряхивающий инкубатор (100 об/мин) при температуре 37 °C до указанных временных точек: 6 ч, День 1, День 2, День 3, День 4, День 5, День 6 и День 7 (Рисунок 1: Шаг 2).
6. В каждый указанный момент времени извлеките шприц и проведите анализ жизнеспособности микроорганизмов в режиме реального времени на 100 мкл бактериальной суспензии (Рисунок 1: Шаг 3-4).
   1. Проведите анализ на основе люминесценции с использованием 96-луночных планшетов с белым непрозрачным дном.
   2. Смешать 100 мкл разведенных бактериальных суспензий со 100 мкл реагента для анализа.
   3. Накройте подготовленную 96-луночную пластину крышкой, накрытой алюминиевой фольгой, и выдерживайте 5 минут при 100 об/мин, встряхивая.
   4. Немедленно измерьте люминесценцию с помощью считывателя микропланшетов, используя следующие настройки в программном обеспечении Gen5 3.11.
      1. Нажмите кнопку « Создать », чтобы настроить протокол в окне «Диспетчер задач ».
      2. Выберите Costar 96 белый непрозрачный в раскрывающемся меню для параметра Тип пластины.
      3. Нажмите « Читать» в меню «Выбрать шаги > действия ».
      4. Нажмите на кнопку «Люминесценция» в окне «Метод чтения». Оставьте выбранные опции Endpoint/кинетическое и Люминесцентное волокно в разделе Тип чтения и Тип оптики соответственно. Нажмите на OK.
      5. Оставьте настройки <по умолчанию> в окне Шаг чтения (усиление = 135; время интегрирования = 1 сек; высота чтения = 4,5 мм). Нажмите на OK.
      6. Окно макета пластины будет готово к запуску. Установите флажок «Использовать крышку» в окне загрузочной пластины и нажмите «ОК».
      7. Поместите 96-луночный планшет в аппарат для считывания значений люминесценции.
7. Определите количество жизнеспособных бактерий за 6 часов, день 1, день 2, день 3 и день 7. Определите КОЕ (колониеобразующие единицы)/мл по единицам люминесценции с помощью соответствующей стандартной кривой.
8. Убедитесь в отсутствии жизнеспособных бактерий в образцах, которые показали значения люминесценции ниже предела обнаружения, выполнив метод распредрасположения пластин на планшетах TSA (триптический соевый агар) и инкубируя при 35 °C в течение ночи. Проверьте наличие колоний на следующий день.
9. Оставшуюся бактериальную суспензию центрифугируйте при 10 000 × г в течение 10 мин и осторожно отсасывайте отработанную среду. Для пробирок, в которых гранулы визуально не видны из-за антибактериальной активности лекарств, оставьте 100 мкл в пробирке, чтобы не потревожить невидимые гранулы (Рисунок 1: Шаг 5).
10. Повторно суспендируйте гранулированные бактерии в свежем MHB и втяните бактериальную суспензию обратно в ту же установку шприца через прилагаемую иглу (Рисунок 1: Шаг 6).

Результаты

Рисунок 1: Схематическое изображение экспериментальной установки.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
АТСС 12600	Коллекция культуры американского типажа, Вирджиния, США
Анализ жизнеспособности микробных клеток BacTiter-Glo	Корпорация Promega, США	Г8231
BD Bacto Триптический соевый бульон (среда для расщепления сои-казеина)	Бектон-Дикинсон, США	БД 211825	Приобретено в Fisher Scientific, США
BD Luer-Lok Шприц стерильный, одноразовый, 3 мл	BD, США	309657
Игла BD 5/8 дюйма одноразовый, стерильный, 25 г	BD, США	305122
Дегидратированные питательные среды BD BBL: бульон Мюллера Хинтона II (с поправкой на катионы)	Бектон-Дикинсон, США	В12322	Приобретено в Fisher Scientific, США
Обезвоженные питательные среды BD Difco: триптический соевый агар (соевый казеиновый дигеджественный агар)	Бектон-Дикинсон, США	ДФ0369-17-6	Приобретено в Fisher Scientific, США
Гентамицинсульфат	Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Фучжоу, Китай
Настольный встряхивающий инкубатор LSE	Корнинг, штат Нью-Йорк, США
Считыватель пластин (Synergy H1	Биотек, Вермонт, США
Шейкер Innova 2100	Нью-Брансуик Сайентикал, Нью-Джерси, США
СВМПЭ	GUR1020, Келанезе, Техас, США
Ванкомицина гидрохлорид	Fagron, Нидерланды	804148