Микрофлюидное моделирование и флуоресцентное отслеживание роста бактерий в одиночных клетках

Аннотация

Источник: Пиоли, Р., и др., Структурирование микроорганизмов и микрочастиц с помощью последовательной капиллярной сборки. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео демонстрируется метод захвата одиночных флуоресцентно меченых клеток Escherichia coli (E. coli) в микрофлюидных ловушках с использованием безуглеродной суспензии и контролируемого потока с последующим добавлением питательных веществ для запуска роста и флуоресцентной визуализацией микроколоний.

Протокол

1. Бактериальный рисунок

1. За день до эксперимента вырастите популяцию кишечной палочки (штамм MG1655 prpsM-GFP). Инокулируйте культуру непосредственно из замороженного сырья и выращивайте в течение ночи в течение 20 ч в среде лизогенного бульона (LB) в шейкерном инкубаторе при 37 °C. Добавьте 50 мкг/мл канамицина, чтобы клетки сохранили плазмиду prpsM-GFP (зеленый флуоресцентный белок).
2. В день эксперимента установите в инкубаторе коробку (рис. 1A) температуру 37 °C за несколько часов до начала эксперимента, чтобы обеспечить равномерную и стабильную температуру перед началом. Затем установите шприцевой насос и нагревательную стеклянную пластину на предметный столик микроскопа (рис. 1B, C), установив температуру на том же уровне, что и в инкубаторе.
   ЗАМЕТКА: Коробчатый инкубатор, в который заключена вся система, включая микроскоп (рис. 1Е), обеспечивает поддержание равномерной и постоянной температуры на протяжении всего эксперимента при промывке канала средой.
3. За девяносто минут до эксперимента поместите микрофлюидный чип в сосуд, наполненный 100% этанолом (EtOH), и промойте канал 100% EtOH в течение не менее 10 минут. Поместите микрофлюидный чип в вакуумный эксикатор и дегазируйте не менее чем на 30 минут. Замените EtOH дистиллированной водой и очистите чип вакуумом не менее 30 минут. Поместите микрофлюидный чип в духовку при температуре 70 °C на 10 минут, чтобы удалить любые следы жидкости, оставшиеся в канале.
   ЗАМЕТКА: Этот шаг необходим для предотвращения образования пузырьков в канале при промывке питательной средой.
4. Нанесите пипеткой 1 мл среды 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (1x) в флакон центрифуги и добавьте 10 мкл 0,132 М фосфата калия (K₂HPO₄). Выньте ночную культуру из инкубатора при температуре 37 °C и добавьте 100 мкл в флакон центрифуги и центрифугируйте культуру при 2 300 × г в течение 2 минут. Аккуратно извлеките надосадочную жидкость из флаконов центрифуги и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл свежей среды MOPS с 0,015% v/v Tween 20 и 0,01% v/v фосфата калия.
   ЗАМЕТКА: Типичная концентрация бактериальной суспензии находится в пределах 0,015-0,15 об.%, что обеспечивает формирование протяженной и подвижной зоны накопления и препятствует накоплению частиц на субстрате. Замена ночного носителя на свежий сводит к минимуму риск выделения пленок бактерий на шаблоне. Отсутствие источника углерода в свежей среде препятствует росту клеток в суспензии во время построения шаблона. Концентрация Tween 20 в 0,015% v/v в суспензии необходима для того, чтобы угол контакта отступающей жидкости на шаблоне PDMS находился в оптимальном диапазоне, от 30 до 60°.
5. Загрузите бактериальную суспензию в шприц объемом 1 мл и подсоедините шприц к чипу через микрофлюидную трубку.
   1. Чтобы закрепить соединение между шприцем и трубкой, непосредственно вставьте в трубку иглу с наружным диаметром 0,6 мм. Чтобы избежать рассеивания оставшейся на входе суспензии по всему каналу, продувайте свежую среду через отверстие, используемое в качестве выходного отверстия в процессе формирования рисунка (рис. 2A-III), а не через отверстие, используемое в качестве входного отверстия.
   2. Установите шприц на шприцевой насос и впрыскивайте суспензию в микрофлюидный чип через входное отверстие, расположенное в верхней части канала, до тех пор, пока суспензия не покроет область шаблона с ловушками. ЗАМЕТКА: В процессе впрыска жидкости воздух может выходить через выпускное отверстие, расположенное на нижнем конце канала.
   3. Настройте шприцевой насос на забор бактериальной суспензии (рис. 2A-I) со скоростью потока 0,07-0,2 мкл/мин, что в описанной геометрии соответствует скорости отступления мениска 80-100 мкм/мин.
   4. Контролируйте процесс нанесения рисунка с помощью программного обеспечения микроскопа.
      ЗАМЕТКА: Здесь 10-кратное увеличение было использовано для мониторинга опущенного мениска на шаблоне, а 20-кратное увеличение было использовано для мониторинга отложения отдельных бактерий в микроизготовленных ловушках.
6. После того, как шаблон был смоделирован с помощью ячеек (рис. 2A-II), увеличьте скорость потока на выходе, чтобы быстро опорожнить микрофлюидный канал, и промойте его свежим LB, который предварительно дегазировался в течение не менее 30 минут и предварительно подогрелся до 30 °C.
7. Установите шприцевой насос на расход 2 μл/мин, чтобы аккуратно промыть канал. После заполнения канала увеличьте расход (15 μл/мин) в соответствии с конкретными экспериментальными потребностями.
8. Получение изображений растущих бактерий с нужным увеличением и временным интервалом.

Результаты

Рисунок 1: Схема платформы для последовательной капиллярной сборки в микрофлюидном канале. (А) Инкубатор для ящиков. Коробчатый инкубатор поддерживает равномерную и постоянную температуру (в данном случае 30 °C) внутри микрофлюидного канала....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шприц BD 10 мл (Люэр-Лок)	БД	300912	Используется для промывки свежего бульона Lysogeny в микрофлюидный канал
Коробчатый инкубатор	Услуги по визуализации жизни		Используется для обеспечения равномерной и постоянной температуры в канале
Центрифуга	Эппендорф	5424Р	Используется для замены ночных сред на свежие минимальные среды
Флакон для центрифуги	Эппендорф	30120086	1,5 мл
CETONI База 120	CETONI GmbH		Шприцевой насос
H401-T-КОНТРОЛЛЕР	Околаб		Контроллер нагреваемой стеклянной пластины
H601-NIKON-TS2R-СТЕКЛО	Околаб		Стеклянная пластина с подогревом
Инсулиновые шприцы, U 100, с люэром	Кодан Медикал АпС	CODA621640	1 мл шприца, используемого для забора жидкой суспензии в процессе нанесения рисунка
LB Бульон, Миллер (Лурия-Бертани)	Научный центр Фишера	244610	Лизогенный отвар промывают в микрофлюидный канал
Передаточная трубка Masterflex	Мастерфлекс	ХВ-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
ШВАБРЫ (10 шт.)	Текнова	М2101	Разбавленный в десять раз водой milliQ и используемый для замены ночной среды
Nikon Eclipse Ti2	Приборы Nikon		Микроскоп
Калийфосфат двухосновной	Сигма Олдрич	П3786	Добавлено в MOPS 1x
Подросток 20	Сигма Олдрич	П1379	Используется для обеспечения оптимального угла отвода контакта в процессе нанесения рисунка