Бактериальный биосенсорный анализ для обнаружения биодоступной ртути в анаэробных условиях

Аннотация

Источник: Stenzler, B. R. et al., Анаэробный биосенсорный анализ для обнаружения ртути и кадмия. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется использование генетически модифицированных бактериальных биосенсоров для точного измерения биодоступной фракции ионов ртути в анаэробных условиях. Варьируя концентрацию сульфата магния, анализ гарантирует, что биосенсор избирательно реагирует на свободные ионы ртути, о чем свидетельствуют изменения интенсивности флуоресценции.

Протокол

1. Экспозиционный анализ

1. Проектирование схемы расположения табличек.
   ЗАМЕТКА: Перед началом анализа воздействия убедитесь, что все значения пипетирования рассчитаны и подготовлены запасы.О том, как правильно спланировать эксперимент и какие элементы управления включить, подробно описано в тексте. Кроме того, эксперимент не следует начинать при наличии кислорода в анаэробной камере, указанной на анаэробном мониторе.
2. Разработайте схему расположения пластин по 96-луночному шаблону. Это позволит провести эксперименты с помощью 32 различных методов обработки в технических копиях 3, которые лучше всего представлены сеткой 4 x 8 для установки флаконов (см. рис. 1).

ЗАМЕТКА: При проверке роли переменной в поглощении Hg с помощью биосенсора, индуцируемого ртутью, для каждой переменной требуется провести две обработки: обработку (биосенсор + ртуть (Hg) + переменная + нитрат) и заготовку для обработки (биосенсор + переменная + нитрат). При тестировании роли переменной в физиологии клетки с использованием конститутивного биосенсора для каждой переменной требуется два лечения: лечение (биосенсор + Hg + переменная + нитрат) и бланк для лечения (биосенсор + переменная + Hg). Ртуть может быть заменена на кадмий (Cd). Hg или Cd станут переменной при выполнении калибровочной кривой. Конститутивные и индуцируемые биосенсоры не обязательно должны запускаться одновременно (в одной и той же схеме расположения). Пример шаблона для компоновки планшета и соответствующей сетки 4 x 8 при испытании диапазона концентраций магния (переменный) представлен в таблице 1.

2. Установите сетку 4 x 8 в соответствии с макетом пробирной пластины.

1. Поместите в лоток стандартные флаконы с политетрафторэтиленом (ПТФЭ) объемом 7 мл.
ЗАМЕТКА: Флаконы из ПТФЭ перед использованием должны быть промыты кислотой или подвергнуты термической стерилизации. С ними следует обращаться только путем манипуляций с внешней стороной флакона.

2. К каждому флакону добавьте объем экспоносители , соответствующий каждой обработке.
ЗАМЕТКА: При экспозиции с общим объемом 2 000 μл (2 мл) добавляемая среда воздействия будет следующей: среда воздействия μL = 2 000 μL – лечебная (холостая) μL. (например, среда воздействия μL = 2 000 – 100 μL (биосенсор) – 40 μL (нитрат) – 100 μL (Hg) – 100 μL (переменная (например, сульфат магния, MgSO₄)) = 1660 μL). Убедитесь, что добавленный объем тестируемой переменной не превышает 5% (100 μл) от конечного объема.

3. Добавьте соответствующий объем раствора испытуемого химического вещества в каждый флакон в соответствии с расположением планшетов.

4. Добавьте селитру в каждый флакон так, чтобы конечная концентрация составила 200 μМ (40-80 μл). Исключите этот шаг для заготовок для обработки конститутивными биосенсорами.

5. Добавьте Hg (5 нМ при тестировании на переменную) или Cd (300 нМ при тестировании на переменную) в флаконы в соответствии с расположением планшета. Исключите этот шаг для заготовок для обработки биосенсоров, индуцируемых ртутью.

1. При использовании Hg возьмите бульон 4-8 мкМ и хорошо встряхните. Раствор развести в экспозиционной среде во флаконе из ПТФЭ объемом 7 мл до 100-250 нМ до получения рабочего раствора ртути. Из этого рабочего раствора добавьте ртуть в необходимые флаконы. В этом случае калибровочная кривая ртутного столба отображается в диапазоне от 0 до 12,5 нМ.
ЗАМЕТКА: При тестировании влияния переменной на биодоступность Hg или Cd убедитесь, что [Hg] или [Cd] остаются постоянными при всех процедурах. При добавлении Hg или Cd обязательно используйте один наконечник для дозатора, но никогда не прикасайтесь к среде воздействия во флаконах.

Встряхивайте орбитальным движением вручную.
ЗАМЕТКА: Эксперимент может быть приостановлен в зависимости от времени, необходимого для видообразования Hg или Cd в растворе. Если оставить на флаконы более чем на час, наденьте на флаконы из ПТФЭ крышки из ПТФЭ, чтобы предотвратить испарение/загрязнение.

Аккуратно пипетируйте приклад биосенсора вперед и назад, чтобы обеспечить однородность. Добавьте 100 μL биосенсорного материала в каждый флакон. Встряхивайте по орбите вручную.

Подготовьте планшетный считыватель к нагреву для считывания по следующим критериям: температура 37°C, кинетический прогон в течение 10 часов со считыванием каждые 2,5-5 минут с орбитальным встряхиванием между считываниями, а также флуоресцентные измерения с возбуждением флуоресценции 440 нм и излучением 500 нм.

Пипетка по 200 мкл из каждого флакона с ПТФЭ в сетке 4 x 8 в соответствующие лунки 96-луночного планшета (черные, 96-луночные несвязывающие поверхностные микропланшеты). Проводите пипетку вперед и назад пять раз перед передачей каждых 200 мкл. ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо того чтобы выбрасывать наконечник пипетки, оставьте наконечник пипетки во флаконе из ПТФЭ, чтобы отслеживать ход пипетирования.

Поместите 96-луночный планшет в лоток считывателя планшетов, затем закройте 96-луночный планшет крышкой и начните анализ.

 

Таблица 1: Пример схемы расположения планшетов для использования биосенсора для проверки биодоступности Hg (5 нМ) по градиенту магния (0-10 мМ)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

a

Hg индуцированный биосенсор + Hg + нитрат + 0 мМ Mg

Hg индуцированный биосенсор + нитрат + 0 мМ Mg

Конститутивный биосенсор + Hg + нитрат + 0 мМ Mg

Конститутивный биосенсор + Hg + 0 мМ Mg

b

Hg индуцированный биосенсор + Hg + нитрат + 0,1 мМ Mg

Hg индуцированный биосенсор + нитраты + 0,1 мМ Mg

Конститутивный биосенсор + Hg + нитрат + 0,1 мМ мг

Конститутивный биосенсор + Hg + 0,1 мМ Mg

c

Hg индуцированный биосенсор + Hg + нитраты + 1 мМ Mg

Hg индуцированный биосенсор + нитраты + 1 мМ Мг

Конститутивный биосенсор + ртуть + нитрат + 1 мМ мг

Конститутивный биосенсор + ртуть + 1 мМ Мг

d

Hg индуцированный биосенсор + Hg + нитрат + 10 мМ Mg

Hg индуцированный биосенсор + нитраты + 10 мМ Mg

Конститутивный биосенсор + ртуть + нитрат + 10 мМ мг

Конститутивный биосенсор + Hg + 10 мМ Mg

Материалы