$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Реагенты для подготовки анализов
- Приготовьте арсенит-цитратный раствор.
- Весят 5 г арсенита натрия и 5 г дигидрата цитрата тринатрия.
ОСТОРОЖНОСТЬ: Арсенит натрия токсичен; Поэтому используйте надлежащие защитные средства и обращайтесь с ними с особой осторожностью. В качестве меры предосторожности не прикасайтесь к ним до тех пор, пока не будут прочитаны и поняты все необходимые меры предосторожности. Работайте только в вытяжном шкафу, чтобы не вдыхать пыль/пары компаунда или его раствора(ов). При вдыхании выйдите на свежий воздух и обратитесь за медицинской помощью. Надевайте соответствующие защитные очки с химическими веществами, защитные перчатки и одежду, чтобы избежать проглатывания и контакта с глазами и кожей. В случае проглатывания немедленно обратитесь в токсикологический центр или к врачу. Если он попал на кожу или в глаза, промойте их большим количеством воды и обратитесь за медицинской помощью. - Растворите в 100 мл воды.
- Добавьте 5 мл ледяной уксусной кислоты, перемешайте и добавьте воды до 250 мл.
- Хранить при комнатной температуре, в защищенном от света месте.
ЗАМЕТКА: Решение стабильно работает уже более года.
- Приготовьте раствор А и раствор Б.
- Для раствора А добавьте 10 мл ледяного 0,5 М HCl (соляной кислоты) к 0,3 г аскорбиновой кислоты. Растворите аскорбиновую кислоту путем вортексирования.
- Для раствора В добавьте 1 мл ледяной воды к 70 мг тетрагидрата гептамолибдата аммония и растворите вихрь.
ЗАМЕТКА: Храните оба раствора на льду до использования. Для постоянства результата анализа оба раствора могут храниться на льду максимум одну неделю.
- Подготовьте стандарт фосфатов (Pi) с концентрацией 0 мкМ, 62,5 мкМ, 250 мкМ и 500 мкМ для калибровки.
- Добавьте 0 μл, 25 μл, 50 μл и 100 μл 5 мМ Na2дигидрата HPO4 (динатрийфосфата) в четыре микропробирки, содержащие 370 μл реакционной смеси.
- Долейте до 1 мл воды.
2. Анализ активности для одного 96-луночного планшета
ЗАМЕТКА: На рисунке 1 показан схематический рабочий процесс анализа.
- Добавьте 1 мл раствора В к 10 мл раствора А, перемешайте путем вортексирования и храните раствор на льду.
ЗАМЕТКА: Этот раствор должен быть прозрачным и желтого цвета. Перед применением раствор А + В подержать на льду не менее 30 минут. Однако используйте раствор в течение 3 часов, так как он испортится после длительного хранения. - Добавьте 40 μL из 0 μM, 62,5 μM, 250 μM и 500 μM Pi в трубку в трех экземплярах с помощью многоканальной пипетки.
ЗАМЕТКА: Реакционная смесь без добавления Pi будет использоваться в качестве заготовки. - Добавьте 25 мкл раствора компаунда в полоски пробирки с помощью многоканальной пипетки.
ЗАМЕТКА: Каждое соединение имеет три различные концентрации в трех экземплярах, что достаточно для первоначальной оценки половины максимальной ингибирующей концентрации (IC50). Для более точного определения IC50 можно использовать восемь различных концентраций соединений. Для расторможенного фермента раствор соединения заменяют равным количеством воды. В качестве положительного контроля использовали 2,5 мкМ, 25 мкМ и 250 мкМ натриевой соли имидодифосфата (ИДФ). - Добавьте 15 мкл смеси раствора mPPase (мембраносвязанной пирофосфатазы) в полоски пробирок (за исключением пробирок, содержащих стандарт Pi) с помощью многоканальной пипетки.
- Заклейте трубные полоски клейким герметизирующим листом. Разрежьте уплотнительный лист, чтобы отделить каждую полосу трубки.
- Предварительно инкубируйте образцы в течение 5 минут при 71 °C. Поместите образцы на нагревательный блок с интервалом 20 с между каждой полоской, чтобы свести к минимуму затраты времени на последующие этапы.
- Для каждой полосы откройте клеевую пломбу. Добавьте 10 мкл 2 мМ пирофосфата натрия двухосновного с помощью многоканальной пипетки и перемешивайте пипетированием вверх и вниз в течение 5×. Снова запечатайте полосу пробирки, используя ту же герметизацию.
ЗАМЕТКА: Первоначально этот шаг может быть трудно выполнить за 20 секунд; Однако после некоторых анализов станет легче. - Выдерживать при температуре 71 °C в течение 5 минут.
- Поместите образцы на охлаждающий аппарат с интервалом 20 с между каждой полосой. Дайте им остыть в течение 10 минут, но после 5 минут охлаждения кратковременно оцентрифугируйте каждую полоску, чтобы капли воды сцедили под уплотнительный лист, затем положите его обратно в охлаждающий аппарат и снимите герметизацию.
ЗАМЕТКА: Охлаждающий аппарат можно просто изготовить, поместив 96-луночную пластину для ПЦР (полимеразной цепной реакции) на чашку Петри из полистирола (размер 150 мм × 15 мм), заполненную водой и замороженную не менее чем на 1 ч. Аппарат следует достать из морозильной камеры примерно за 5 минут до начала анализа. Не вынимайте охлаждающий аппарат непосредственно перед охлаждением образца, так как это приведет к замораживанию реакционной смеси и затруднит развитие цвета. - После 10 минут охлаждения добавьте 60 μL раствора A + B, перемешайте пипетированием вверх и вниз в течение 5× и подержите полоски пробирок на охлаждающем аппарате в течение 10 минут.
- Добавьте 90 мкл раствора арсенит-цитрата и выдержите при комнатной температуре не менее 30 минут до получения стабильного синего цвета.
ОСТОРОЖНОСТЬ: Из-за его токсичности со всеми растворами, содержащими арсенит натрия, следует всегда обращаться с особой осторожностью. Таким образом, добавление арсенит-цитратного раствора следует производить в вытяжном шкафу. - Диспонируйте по 180 мкл каждой реакционной смеси в прозрачную 96-луночную микропластину из полистирола.
- Измерьте поглощение каждой лунки на длине волны 860 нм с помощью микропланшетного спектрофотометра.
