Визуализация белков прорастания во внутренней мембране бактериальных спор

Аннотация

Источник: Wen, J., Pasman, et al., Visualization of Germinosomas and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется использование микроскопии структурированного освещения для получения трехмерных флуоресцентных изображений, которые выявляют организацию белков прорастания в бактериальной споре.

Протокол

1. Визуализация белка проращивания (время: 1 ч)
   1. Получение изображений пропускания и флуоресценции спор, а также смеси красных и желто-зеленых карбоксилат-модифицированных флуоресцентных микросфер на микроскопе структурированного освещения (см. Таблицу материалов), оснащенном 100-кратным масляным объективом (числовая апертура = 1,49), ПЗС-камерой (устройством с зарядовой связью) и программным обеспечением для анализа изображений (см. Таблицу материалов)). Создавайте все изображения при комнатной температуре без помех окружающего освещения. Перед съемкой обязательно очищайте объектив 100x и предметное стекло 75% этанолом.
   2. Сфокусируйтесь на флуоресцентных микросферах диаметром 100 нм и оптимизируйте функцию рассеяния точки (PSF), регулируя корректирующее кольцо на объективе 100x до получения симметричного PSF, тем самым сводя к минимуму размытие изображения. PSF — это импульсная характеристика или реакция системы визуализации на точечный источник или точечный объект.
   3. Выберите поле зрения с примерно 10 круглыми флуоресцентными микросферами. Примените регулировку фокуса решетки для длин волн возбуждения 561 нм и 488 нм в качестве руководства для программного обеспечения для анализа изображений.
   4. Сфокусируйте споры с помощью света пропускания и сделайте снимок света пропускания в среднем режиме 16× с выдержкой 200 мс для каждого изображения.
   5. Захват необработанных флуоресцентных изображений спор в формате 3D-SIM с подсветкой в режиме "3D-SIM", настройками камеры в режиме считывания коэффициента умножения электронов (ЭМ) 10 МГц при 14 битах и усилением ЭМ при 175 бит. Возбуждайте зонд FM4-64 в спорах PS4150 лазерным светом с длиной волны 561 нм при мощности лазера 20% и времени подсветки 400 мс.
   6. Возбуждайте GerKB-mCherry и GerD-GFP в спорах KGB80, соответственно, лазерным светом 561 нм при 30% мощности лазера в течение 1 с и лазерным светом 488 нм при 60% мощности лазера в течение 3 с. Настройки Z-Stack находятся в режиме сверху вниз, 0,2 мкм/шаг.
      ЗАМЕТКА: Эти параметры лазера были применены для обеспечения максимального значения яркости около 4000 для окна гистограммы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стеклянные предметные стекла с сушкой на воздухе	Менцель Глезер	630-2870
APO TIRF N20R8 100× масло объективное (NA=1,49)
Bacillus subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
Bacillus subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Флюосферы, карбоксилат-модифицированные микросферы	Invitrogen, 0,1 мкм	Ф8803
ФМ4-64	Thermo Fisher Scientific	Ф34653
Неионогенная градиентная среда Histodenz	Сигма-Олдрич	Д2158
Изображение J
ПЗС-камера iXON3 DU-897 X-6515	Технология Andor		https://imagej.net/Welcome
Программное обеспечение для визуализации под микроскопом	Nikon, Япония	NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ультрачистая деминерализованная вода	Многородность	Милли-К IQ 7003
Микроскоп Nikon Eclipse Ti
Прецизионные покровные стекла	Пауль Мариенфельд	117650
Пробирки с завинчивающейся крышкой 50 мл	Thermo Fisher Scientific		ТМ Nunc