Трансфекция амеб дикого типа с помощью электропорации с поддержкой бактериального питания

Аннотация

Источник: Paschke, P., et al. Генная инженерия клеток Dictyostelium discoideum на основе отбора и роста бактерий. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео показана процедура введения плазмиды, несущей ген-мишень, в клетки амебы с помощью электропорации с последующим восстановлением в бактериальной добавке для обеспечения эффективной доставки генов у амеб дикого типа.

Протокол

1. Настройка клеток Dictyostelium для трансфекции
   1. Выращивайте Klebsiella aerogenes до слияния в среде SM (обезжиренное молоко) (среда, богатая питательными веществами) в течение ночи при RT (комнатной температуре). Культуры могут храниться до 2 недель при температуре 4 °C.
   2. Добавьте около 400 мкл этой бактериальной суспензии на агаровую пластину SM (пептон 10 г/л; экстракт дрожжей 1 г/л; глюкоза 10 г/л; KH₂PO₄ 1,9 г/л; K₂HPO₄ x 3 H₂O, 1,3 г/л; MgSO₄ безводный 0,49 г/л; 1,7% агара) и равномерно распределить. Возьмите стерильную петлю и привите клетки Dictyostelium . Разложите ячейки по одному краю тарелки.
   3. Инкубируйте пластину при температуре 22 °C в течение 2 дней, чтобы обеспечить достаточно большие зоны роста для трансфекции.
      ЗАМЕТКА: Для штаммов Dictyostelium , которые не образуют больших зон роста (например, Ax3, DH1 или JH10), или для неопытных экспериментаторов используйте вместо этого очищающие пластины.
   4. Возьмите стерильную петлю и привите клетки Dictyostelium (примерно 2-4 х^{10 5} клеток). Перенесите клетки в 800 мкл плотной суспензии K. aerogenes в SM. Смешайте клетки с помощью пипетирования вверх и вниз.
   5. Переложите 400 μл, 200 μл, 100 μл и 50 μл на свежие пластины с агаром SM. Добавьте в каждую тарелку по 400 μл дополнительной суспензии SM K. aerogenes , равномерно распределите и высушите.
   6. Инкубируйте пластины при температуре 22 °C в течение примерно 2 дней, пока пластины не станут полупрозрачными.
      ЗАМЕТКА: Из-за более быстрой скорости роста бактерии первоначально образуют сливающийся газон, а амебы впоследствии «очищают» пластину от бактерий. Время, необходимое для этого процесса, может варьироваться в зависимости от фона штамма и способности мутантных клеток расти на бактериях.

2. Трансфекция клеток Dictyostelium на основе бактериального отбора

1. Для приготовления планшетов с суспензией K. aerogenes добавьте 10 мл буфера SorMC, содержащего бактерии K. aerogenes с плотностью OD (оптическая плотность) ₆₀₀ = 2 (добавьте 200 мл приготовленного OD₆₀₀ = 100 стокового раствора K. aerogenes для желаемой концентрации бактерий) в чашку Петри, обработанную тканевой культурой.
   ЗАМЕТКА: Эта пластина в дальнейшем необходима для культивирования трансфицированных клеток D. discoideum . В качестве альтернативы можно использовать 6-луночный планшет для культивирования тканей. В случае трансфекции экстрахромосомных плазмид 6-луночный тканевый планшет является более ресурсоэффективным. Используйте 2 мл суспензии K. aerogenes SorMC (OD₆₀₀ = 2) на лунку.
2. Получение клеток Dictyostelium
   1. С помощью одноразовой петли для посева объемом 10 мкл соскребите клетки из зон роста (примерно 3 см) культуральной пластины (края очищаемой области) или очищающей пластины. Перенесите клетки в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл ледяного буфера H40.
      ЗАМЕТКА: Время уборки ячеек с очищающих пластин имеет решающее значение. Слишком ранний сбор дает слишком малое количество клеток, в то время как поздний сбор увеличивает риск получения частично развитых клеток.
   2. Промойте ячейки путем отжима в течение 2 мин при 1 000 x g или мгновенным вращением в течение 2 с при 10 000 x g. Отбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в буфере H40 до конечной плотности 2-4 x 10⁷ клеток/мл. Держите клетки в холоде в течение всей процедуры трансфекции. Используйте суспензию для льда и воды, чтобы обеспечить прямой контакт трубок со льдом.
3. Электропорация
   1. Добавьте 100 мкл клеток в пробирку с 1-2 мкг ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
   2. Перенесите смесь клетки/ДНК в предварительно охлажденную электропорационную кювету (зазор 2 мм).
   3. Импульсное воздействие на ячейки осуществляется с использованием следующих прямоугольных настроек: 350 В, 8 мс, 2 импульса и интервал импульсов 1 с.
      ЗАМЕТКА: Не добавляйте более 2 мкг ДНК. Более высокие количества токсичны для клеток и снижают эффективность трансфекции. Общий объем добавляемой ДНК не должен превышать 5 мкл.
   4. Немедленно перенесите клетки в заранее приготовленную 10-сантиметровую чашку Петри с K. aerogenes SorMC и дайте клеткам восстановиться в течение 5 ч.
      ЗАМЕТКА: Проверьте клетки в чашке Петри под перевернутым микроскопом. Клетки будут выглядеть круглыми сразу после электропорации, но вернутся к своей амебоидной форме примерно через 30 минут, когда у них будет достаточно времени, чтобы правильно прикрепиться к поверхности.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микроцентрифуги Eppendorf 5424/5424R	ТермоСайентиал	05-400-002
Центрифуги Eppendorf 5702R с ротором модели A-4-38	ТермоСайентиал	12823252
Сейфовый шкаф Foruna - SCANLAF	Лабоген
БиоФотометр Плюс	Эппендорф
КЛСМ 710	Цейсс
Очищенный агар	Оксоидный	ЛП0028
Бульон SM	Для средних	SMB0102
2x LB бульона	Для средних	LBD0102
Свободная кислота HEPES	Сигма Олдрич/Мерк	391340 ЭМД
КХ₂PO₄	ВВР	/4800/53
Na₂HPO₄ 2H₂O	ВВР	10028-24-7
MgCl₂ 6H₂O	Сигма Олдрич/Мерк	5982 ЭМД
CaCl₂ 2H₂O	Сигма Олдрич	442909
Фолиевая кислота	Сигма Олдрич	Ф7876
КО	ВВР	26668.263
Чашка для культуры тканей 100 x 20 мм, обработанная культурой тканей	Корнинг Инкорпорейтед	353003
Электропорационные кюветы с зазором 2 мм, длинный электрод	Генепоток Лимитед	Е6-0062
10 μл Инокуляционный контур, синий 10 мкл	ТермоСайентиал	129399
Разбрасыватель, Г-образный, стерильный	Greiner Bio-One	730190