Визуализация бактериальных взаимодействий одиночных клеток

Аннотация

Источник: Yarringto, K.D., et al. Кинетическая визуализация межвидовых бактериальных взаимодействий между отдельными клетками. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео показано приготовление кокультурной системы с использованием подвижных и неподвижных бактерий под агарозной прокладкой для визуализации живых клеток. Он показывает, как подвижные бактерии обнаруживают химические аттрактанты и вторгаются в неподвижные колонии, выявляя бактериальные взаимодействия.

Протокол

1. Подготовка бактериальных клеток и инокуляционных прокладок

1. Измерьте оптическую плотность, OD₆₀₀, каждой субкультуры и разбавьте Pseudomonas aeruginosa до OD₆₀₀ = 0,03 и Staphylococcus aureus до OD₆₀₀ = 0,10 в M8T (минимальная среда 8 + триптон), предварительно нагретый до 37 °C. Смешайте P. aeruginosa и S. aureus в соотношении 1:1 и вихре.
   ЗАМЕТКА: Если штаммы требуют антибиотиков, их можно добавлять в субкультуру на ночь и в субкультуру, но их не следует добавлять при смешивании видов для визуализации, если они влияют на другие виды в кокультуре. Стабильность плазмид и влияние антибиотиков на все виды в кокультуре должны быть определены для каждого используемого организма/плазмиды.
2. Равномерно нанесите пипеткой 1 мкл кокультуры на дно предварительно подогретой стерильной стеклянной формы диаметром 35 мм.
3. Извлеките силиконовый вырез из формы с помощью стерильного пинцета.
4. Снимите подушечку с посуды с помощью стерильных шпателей.
   1. Просуньте слегка согнутый шпатель под край прокладки, держа форму вверх дном, чтобы выбросить ее на стерильную крышку тарелки Петри.
      ЗАМЕТКА: Не вынимайте прокладку с усилием, иначе она порвется. Следите за тем, с какой стороны прокладки находится дно.
5. Перенесите подушечку в чашку с бактериальными клетками дном вниз, просунув лопатку под углом 90° под подушечку и положив ее поверх привитого покровного стекла. Используйте шпатель, расположенный под углом 90°, чтобы подушечка прилегала заподлицо к покровному стеклу, и аккуратно выдавите все пузырьки воздуха.
6. Удалите лишнюю влагу с влажных салфеток и положите их по краю блюда, следя за тем, чтобы они не касались подушечки. Теперь образец готов к визуализации.

Материалы