Обогащение бактериальных липопротеидов с помощью неионогенного детергентного разделения фаз

Аннотация

Источник: Армбрустер, К. М., Мередит, Т. С. Обогащение бактериальными липопротеинами и получение N-концевых липопептидов для структурного определения методом масс-спектрометрии. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео показано обогащение бактериальными липопротеинами с помощью неионогенного детергента, который подвергается фазовому разделению при нагревании. С помощью последовательных температурных сдвигов и этапов центрифугирования липопротеины избирательно разделяются на детергентную фазу, в то время как загрязняющие вещества, не являющиеся липопротеинами, удаляются. Затем обогащенные липопротеины осаждаются, промываются и ресуспендируются для последующего применения.

Протокол

1. Обогащение липопротеидов методом фазового разделения Triton X-114 (TX-114)

1. Дополните бактериальный лизат поверхностно-активным веществом TX-114 до конечной концентрации 2% (об/об) путем добавления равного объема 4% (об/об.) поверхностно-активного вещества в ледяной трис-буферный раствор / этилендиаминтетрауксусную кислоту (TBSE) и инкубируйте на льду в течение 1 часа, перемешивая путем инверсии каждые ~15 минут.
   ЗАМЕТКА: В охлажденном состоянии надосадочная жидкость и поверхностно-активное вещество будут смешиваться.
2. Поместите трубку на водяную баню с температурой 37 °C и инкубируйте в течение 10 минут, чтобы вызвать разделение фаз. Центрифугируйте образец при давлении 10 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре для поддержания двухфазного разделения.
3. Аккуратно отпижите верхнюю водную фазу и выбросьте. Добавьте ледяной TBSE в нижнюю фазу поверхностно-активного вещества, чтобы наполнить пробирку до исходного объема и перевернуть ее для смешивания. Выдерживать на льду в течение 10 минут.
4. Поместите пробирку на водяную баню при температуре 37 °C и инкубируйте в течение 10 минут, чтобы вызвать разделение фаз, затем центрифугируйте при 10 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре.
5. Повторите шаги 1.3-1.4 еще раз, всего 3 отделения. Удалите верхнюю водную фазу и выбросьте.
6. Удалите гранулы осажденных белков, образовавшихся в ходе экстракции (видимые на дне пробирки), добавив 1 объем ледяного TBSE в фазу поверхностно-активного вещества. Центрифугируйте при 4 °C при 16 000 x g в течение 2 мин для гранулирования нерастворимого белка.
   ЗАМЕТКА: На пробе должна оставаться одна фаза. Если происходит разделение фаз, повторно охладите образец и снова центрифугируйте. Гранулы обычно состоят из загрязняющих веществ, не содержащих липопротеинов, но могут быть сохранены для дальнейшего анализа.
7. Немедленно перенесите надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 мл, содержащую 1250 мкл 100% ацетона. Тщательно проведите пипеткой вверх и вниз, чтобы смыть образец с наконечника, так как он будет вязким. Перемешайте методом инверсии и инкубируйте в течение ночи при -20 °C до образования белка.
8. Центрифугируйте образец при давлении 16 000 x g в течение 20 минут при комнатной температуре для гранулирования липопротеинов, уделяя внимание ориентации пробирки. Липопротеины образуют тонкую белую пленку вдоль внешней стенки трубки.
9. Дважды промойте гранулу со 100% ацетоном. Сцедите ацетон и дайте образцу высохнуть на воздухе.
10. Добавьте 20-40 мкл 10 мМ трис-гидрохлорида, pH 8,0 или стандартный буфер для проб Laemmli SDS-PAGE и тщательно ресуспендируйте путем пипетирования вверх и вниз у стенки с осажденными липопротеинами. Соскребите кончиком пипетки боковую сторону пробирки, чтобы удалить липопротеины.
    ЗАМЕТКА: Липопротеины не растворяются в Трис-буфере, а образуют суспензию.
    1. Хранить липопротеины при температуре -20 °C до использования.

Материалы