Очистка бактериальных рекомбинантных белков Р-домена норовируса человека

Аннотация

Источник: Leuthold, M. M., et al. Получение выступающих доменов норовируса человека в кишечной палочке для рентгеновской кристаллографии. J. Vis. Exp. (2016).

В этом видео демонстрируется очистка рекомбинантного домена норовируса человека P с помощью эксклюзионной хроматографии, подчеркивающей отделение целевого белка от примесей с более высокой и низкой молекулярной массой на основе дифференциальной доступности пор. Процесс контролируется с помощью поглощения ультрафиолета и подтверждается с помощью анализа элюированных фракций SDS-PAGE.

Протокол

1. 3-я ступень очищения

1. Промойте насосы и трубопроводы системы очистки ВЭЖХ (высокопроизводительной жидкостной хроматографии) и предварительно уравновесьте колонку SEC (Size exclusion chromatography) (см. Список материалов) с помощью GFB (Gel filtration buffer).
2. Введите домен P в колонку со скоростью потока 1 мл/мин с помощью суперпетли (до 12 мл) или петли (до 3 мл), в зависимости от объема концентрированной пробы. После окончания инъекции увеличьте скорость потока до 2,5 мл/мин.
3. По мере увеличения OD (оптической плотности) и отрыва Р-домена от колонки собирают фракции по 1,5 мл. Проверьте фракции с помощью SDS-PAGE с 12% гелем (рис. 1А и 1В). Объединяйте только самые чистые фракции и концентрируйте до ~ 3 мг/мл и ~ 8 мг/мл.
   Примечание: После ~110 мл (объем пустот) большинство примесей удаляется из колонки SEC с объемом слоя 320 мл. Домен P обычно элюируется в виде димера. Время/объем элюирования димера P-домена зависит от преп-класса (pg) столбца SEC.

Результаты

Рисунок 1. Схематические и репрезентативные результаты для 3-го этапа очистки.
Хроматограмма элюирования Р-домена с использованием SEC и соответствующего результата SDS-PAGE. Черные цифры обозначают дроби, которые собираются. А

Материалы