Селективная очистка бактериального белка методом отрицательной ионообменной хроматографии

Аннотация

Источник: Kuo, T., et al. Одномоментная негативная хроматографическая очистка белка, активирующего нейтрофилы Helicobacter pylori , сверхэкспрессирующегося в Escherichia coli в периодическом режиме. J. Vis. Exp. (2016)

В видео демонстрируется метод негативной хроматографии для очистки белка, связанного с вирулентностью, из бактериального лизата. При использовании положительно заряженной смолы в буферизованном растворе белки клетки-хозяина избирательно сохраняются, в то время как почти нейтральный белок-мишень остается несвязанным и собирается в проточном потоке. Этот метод обеспечивает эффективное разделение и восстановление целевого белка для последующих применений.

Протокол

1. Экспрессия рекомбинантного HP-NAP в Escherichia coli (E. coli)

1. Получают плазмиду pET42a-NAP, содержащую последовательность ДНК белка, активирующего нейтрофилов Helicobacter pylori (HP-NAP) из штамма H. pylori 26695, как описано ранее. Получить плазмиды, содержащие последовательность ДНК HP-NAP с желаемыми точечными мутациями.
2. Трансформируйте 10 нг из вышеуказанных плазмид ДНК в компетентные клетки E. coli BL21 (DE3) с помощью теплового шока в течение 45 секунд при 42 °C, поместите клетки на агаровые пластины лизогенного бульона (LB), содержащие 50 мкг/мл канамицина, и инкубируйте пластины при 37 °C в течение 16 часов.
3. Инокулировать отдельные колонии в отдельные пробирки, содержащие 5 мл LB-бульона, с 50 мкг/мл канамицина и выращивать их в качестве прекультур при 37 °C в течение 16 ч с встряхиванием при 170 об/мин.
4. Инокулируйте 2 мл вышеуказанных предкультурных клеток в 200 мл LB бульона, содержащего 50 мкг/мл канамицина, в колбе объемом 1 л. Инкубируйте колбу с инокулированной культурой при 37 °C в течение 2 ч с встряхиванием при 170 об/мин до тех пор, пока абсорбция на длине волны 600 нм не достигнет примерно 0,4-0,5, обнаруженных спектрофотометром в ультрафиолетовом видении (UV/VIS).
5. Добавьте 80 мкл 1 М изопропил β-D-1-тиогалакпиранизида (IPTG) в вышеуказанную культуру до конечной концентрации 0,4 мМ для индуцирования экспрессии HP-NAP. Инкубируют культуру в течение 3 ч до тех пор, пока абсорбция при 600 нм не достигнет примерно 1,6-1,7.
6. Центрифугируйте клетки при 6000 x g при 4 °C в течение 15 мин для удаления надосадочной жидкости. Храните клеточную гранулу при температуре −70 °C до очистки.

2. Получение растворимой белковой фракции, содержащей HP-NAP

ЗАМЕТКА: Все следующие шаги выполняются при температуре 4 °C.

1. Ресуспендируйте 50 мл клеточной гранулы, приготовленной на этапе протокола 1.6, в 20 мл 20 мМ Tris-HCl, pH 9,0, 50 мМ NaCl, содержащего 0,13 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 0,03 мМ N-альфа-тозил-L-лизинил-хлорметилкетона (TLCK) и 0,03 мМ N-тозил-L-фенилаланинилхлорметилкетона (TPCK) при 4 °C, как описано ранее.
2. Разрушайте бактериальные клетки, пропуская бактериальную суспензию через гомогенизатор высокого давления, работающий при давлении от 15 000 до 20 000 фунтов на квадратный дюйм, в течение 7 раз при 4 °C.
3. Центрифугируйте лизат клеток при 30 000 × г при 4 °C в течение 1 часа, чтобы разделить растворимые и нерастворимые белковые фракции с помощью ультрацентрифуги. Перенесите надосадочную жидкость в виде растворимой белковой фракции в стакан.
4. Измерьте концентрацию белка растворимой белковой фракции методом Брэдфорда с использованием коммерческого набора с бычьим сывороточным альбумином (BSA) в качестве стандарта, в соответствии с инструкциями производителя.
5. Добавьте 177,6 мкл 1 Н HCl в 20 мл растворимой белковой фракции, полученной на этапе 2.3 протокола, чтобы скорректировать значение pH от pH 9,0 до pH 8,0.
6. Добавьте 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 50 мМ NaCl к вышеуказанному белковому раствору, чтобы получить конечную концентрацию белка 0,5 мг/мл.

3. Очистка рекомбинантного HP-NAP от E. coli методом периодической хроматографии с отрицательным режимом ионообменных смол DEAE

1. Приготовьте 15 мл диэтиламиноэтильных (ДЭАЕ) смол.
   1. Отвесить 0,6 г сухого порошка смол DEAE и суспендировать его в 30 мл 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl при комнатной температуре не менее 1 суток.
   2. Центрифугируйте смолу при 10 000 x g при 4 °C в течение 1 минуты.
   3. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
   4. Добавьте 15 мл 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 50 мМ NaCl.
   5. Повторите шаги протокола с 3.1.2 по 3.1.4 еще четыре раза.
   6. Храните 15 мл осевшей смолы (50% суспензии в 30 мл буфера Tris) при температуре 4 °C для последующего использования.
      ЗАМЕТКА: Все следующие шаги выполняются при температуре 4 °C.
2. Добавьте 45 мл растворимых белков, приготовленных на этапе протокола 2.6, к 15 мл смолы и перемешайте суспензию белка/смолы с помощью магнитной мешалки при температуре 4 °C в течение 1 часа.
3. Налейте суспензию из белка и смолы в пластиковую или стеклянную колонку с запорным краном. Дайте смоле осесть под действием силы тяжести.
4. Откройте запорный кран, чтобы белковый раствор мог проходить через колонну под действием силы тяжести, пока уровень жидкости в колонне не не окажется чуть выше смолы. Соберите проточный поток в виде несвязанной фракции, которая содержит очищенный HP-NAP.
5. Добавьте в колонку 15 мл ледяного 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl.
6. Откройте запорный кран, чтобы промывочный буфер мог проходить через колонну под действием силы тяжести, пока уровень жидкости в колонне не не окажется чуть выше смолы. Соберите проточную жидкость в качестве промывочной фракции.
7. Повторите шаги протокола с 3.5 по 3.6 еще четыре раза, чтобы собрать дополнительные фракции смывателя.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Материал
pET42a-NAP	Н/Д	Н/Д	подготовлено в соответствии с Дополнительными данными Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
Кишечная палочка BL21 (DE3)	Thermo Fisher Scientific Inc	С6000-03	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
Канамицин	Амреско	25389-94-0	http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
Изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG)	MD Biomedical Inc	101-367-93-1	http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name=IPTG%20
Фенилметилсульфонилфторид (PMSF)	Сигма-Олдрич	10837091001	ингибитор протеазы
N-альфа-тозил-L-лизинил-хлорметилкетон (ТЛСК)	Сигма-Олдрич	Т7254	ингибитор протеазы http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW
N-тозил-L-фенилаланинил-хлорметилкетон (ТПК)	Сигма-Олдрич	Т4376	ингибитор протеазы http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW
Стандарт белка (бычий сывороточный альбумин)	Сигма-Олдрич	П5619	стандартный белок для анализа на белок Bio-Rad http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW
Форма хлорида ДЭАЕ–Сефадекса А-25	Сигма-Олдрич	А25120	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW
Диализные трубки Spectrum/Por	Лаборатории «Спектрум»	132720	с отсечкой по молекулярной массе 14 кДа http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Кишечная палочка DH5α	Thermo Fisher Scientific Inc	18265-017	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
U-2800 двухлучевой УФ/ВИД спектрофотометр	Хитачи	Н/Д	снят с рынка и модернизирован до новой модели http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
Гомогенизатор высокого давления EmulsiFlex-C3	Авестин Инк	C315320	http://www.avestin.com/English/c3page.html
Универсальная ультрацентрифуга Hitachi Koki himac CP80WX	Хитачи Коки Ко	90106401	для выделения растворимых и нерастворимых белковых фракций из лизатов E. coli http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html