Процедура очистки белка, меченного полигистидином, из Streptococcus mutans

Аннотация

Источник: Мурата, Т., и др. Очистка белка с высокой молекулярной массой у Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео показана пошаговая процедура очистки белка, меченного полигистидином, секретируемого из Streptococcus mutans.

Протокол

1. Сконцентрируйте белки из надосадочной жидкости культуры методом осаждения сульфата аммония.
   ЗАМЕТКА: Извлекают из тел клеток, если целевой белок является внутриклеточным.
   1. Центрифугируйте суспензию бактериальной культуры (Streptococcus mutans) в течение 20 мин при 10 000 x g при 4 °C. Восстановите надосадочную жидкость культуры в стеклянную стакан объемом 3 л.
   2. Добавьте 1,122 г сульфата аммония к 2 л надосадочной жидкости (80% насыщения) при энергичном перемешивании с помощью магнитной мешалки. Дайте осадку образоваться в течение 4 часов или более при 4 °C при перемешивании.
      ЗАМЕТКА: Образование осадка может продолжаться в течение ночи.
   3. Центрифугируйте раствор, осажденный сульфатом аммония, при 15 000 x g в течение 20 мин при 4 °C. Сцедите надосадочную жидкость.
   4. Соберите осадок с помощью шпателя и переложите в стеклянный стакан объемом 200 мл. Ресуспендируйте гранулы в 35 мл связывающего буфера (50 мМ₂PO₄, 300 мМ NaCl, 5 мМ имидазола, pH 8,0).
   5. Диализ суспензии против 2500 мл связывающего буфера с помощью регенерированной целлюлозной диализной трубки при температуре 4 °C при перемешивании. Замените диализный раствор через 2 ч и продолжайте диализ в течение ночи.
   6. Снова замените диализный раствор. Продолжайте диализ еще 2 часа.
2. Диализованную суспензию центрифугировать при концентрации 20 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Отфильтровать надосадочную жидкость через мембранный фильтр с помощью всасывающего фильтрующего оборудования. Переложите фильтрат в колбу размером^{75 см 2} см.
3. Фракционирование меченной полигистидином глюкозилтрансферазы-SI (GTF-SI) из фильтрованной суспензии методом иммобилизованной аффинной хроматографии металлов (IMAC).
   1. Перенесите 2 мл суспензии из никель-заряженной смолы IMAC (примерно 1 мл смолы) в хроматографическую колонку, выходное отверстие которой расположено в силиконовой трубке. Удалите накопительный раствор под действием силы тяжести.
      ОСТОРОЖНОСТЬ: Не допускайте высыхания смолы по всему IMAC.
   2. Добавьте в колонну 3 мл дистиллированной воды, чтобы промыть смолу. Добавьте 5 мл связующего буфера, чтобы сбалансировать смолу.
   3. Перекройте поток с помощью пережимательного крана Гофмана. Добавьте 5 мл отфильтрованной суспензии из шага 2, чтобы получилась каша.
   4. Добавьте всю кашицу в оставшуюся процеженную суспензию. Аккуратно взбивайте смесь в течение 30 минут при температуре 4 °C.
   5. Загрузите смесь обратно на колонну. Снимите суспензию под действием силы тяжести. Промойте смолу IMAC 20 мл связующего буфера.
      ЗАМЕТКА: Отрегулируйте расход примерно до 2 мл/мин с помощью пережимательного крана Гофмана в течение всего последующего IMAC.
   6. Разбавьте рекомбинантный GTF-SI 20 мл элюирующего буфера (50 мМ₂PO₄, 300 мМ NaCl, 500 мМ имидазола, pH 8,0).
      ЗАМЕТКА: Протокол можно поставить на паузу здесь. Элюат следует хранить при температуре 4 °C. Смолу IMAC можно использовать повторно.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Центробежная ультрафильтрационная установка	Сарториус	ВС2032	Замена буфера и концентрация белка
Центрифуга	Кубота	7780ІІ
Хроматографическая колонка	Био-Рад	7321010	Для IMAC
Зажим для диализной мембраны	Бренд Fisher	21-153-100
Диализные трубки	Как единое целое	2-316-06
Имидазол	Вако	095-00015	Подготовка буфера для связывания и буфера элюирования
Инкубатор	Nippon Medical & Chemical Instruments	ЛХ-100-РДС	Настройка температуры: 37 °C
Микроцентрифуга	Кубота	3740
Хлористый содь	Вако	191-01665	Приготовление связующего буфера и буфера элюирования
Дигидрат дигидрофосфата натрия	Вако	192-02815	Приготовление связующего буфера и буфера элюирования
Гидроксид натрия	Вако	198-13765	Приготовление связующего буфера и буфера элюирования
Сульфат аммония	Вако	015-06737	Осаждение сульфата аммония
Никель-заряженная смола	Био-Рад	1560133	Для IMAC
Мембранный фильтр	Мерк Миллипор	JGWP04700	Диаметр 0,2 μм