Измерение связывания препарата с казеумом из пораженных туберкулезом методом быстрого равновесного диализа

Аннотация

Источник: Sarathy, J. P. et al. Анализ связывания казеума in vitro , который прогнозирует проникновение лекарственных препаратов при поражениях туберкулезом. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео демонстрируется анализ in vitro для измерения связывания лекарственного средства с казеумом из пораженных туберкулезом с использованием быстрого равновесного диализа. В нем описаны этапы приготовления казеумных суспензий, проведения диализа и расчета несвязанной фракции лекарственного средства для прогнозирования проникновения лекарственного средства в казеум.

Протокол

1. Быстрый равновесный диализный анализ (RED)

1. Добавьте 6,5 мкл 500 мкМ раствора испытуемого соединения в 643,5 мкл гомогената для достижения конечной концентрации 5 мкМ (≤1% ДМСО) и вихря.
2. Поместите вставки RED в опорную плиту. Добавьте 200 мкл матрицы с лекарственным спайком в донорскую камеру (красное кольцо) каждой вставки RED и 350 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) в каждую камеру приемника. Подготовьте по 3 вставки для каждого исследуемого соединения (тройные образцы). Уплотните пластину с помощью клейкой пластины и инкубируйте при 37 °C на термомиксере при 200 об/мин (1 x g) в течение 4 часов.
3. После инкубации аккуратно перемешайте содержимое донорской и реципиентной камер пипетированием вверх и вниз 2-3 раза. Выведите 20 мкл аликвот гомогената из донорских камер и добавьте к 20 мкл чистого PBS в пробирке объемом 1,5 мл (1:1). Аналогичным образом, пипетку выводят 20 мкл аликвот образцов PBS из камер приемника и добавляют к 20 мкл чистого гомогената (матричное согласование).
   ЗАМЕТКА: Матричное согласование устраняет необходимость в создании 2 отдельных калибровочных кривых (в гомогенате и PBS) для количественного анализа. Содержимое донорской камеры со временем может осадиться. Аккуратно перемешайте содержимое с помощью пипетки перед удалением аликвот.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Устройство Pierce RED Многоразовая опорная пластина	Научный центр Фишера	ПИ-89811
Вкладыши для устройств Pierce RED, 50/коробка	Научный центр Фишера	ПИ-89809
Инструмент для снятия пластины Pierce RED	Научный центр Фишера	89812
Пломба для клеевых пластин	Научный центр Фишера	08-408-240
PBS, pH 7,4, 10x 500 мл (Gibco)	Технологии Life	10010-049
ДМСО	Сигма	472301