Микрофлюидная покадровая микроскопия для изучения персистенции антибиотиков у бактерий

Abstract

Источник: Oms, T., et al. Популяционный и одноклеточный анализ персистенции антибиотиков у Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2023)

В этом видео представлен протокол мониторинга отдельных бактериальных клеток, экспрессирующих флуоресцентно меченный ДНК-связывающий белок в микрофлюидной системе. Это иллюстрирует, как антибиотики подавляют большинство клеток, в то время как субпопуляция персистирующих клеток выживает после лечения и восстанавливается после удаления антибиотиков.

Protocol

Микрофлюидная покадровая микроскопия

ЗАМЕТКА: В следующем разделе описывается подготовка микрофлюидной пластины, а также процедура получения и анализа изображений с помощью интервальной съемки. Целью данного эксперимента является наблюдение и анализ фенотипа персистенции при лечении антибиотиками на уровне отдельных клеток. Данные, собранные в ходе этого эксперимента, могут быть использованы для получения широкого спектра результатов в зависимости от рассматриваемого вопроса и/или флуоресцентных репортеров, использованных во время эксперимента. В описанном здесь эксперименте был проведен количественный анализ длины клетки и флуоресценции HU-mCherry, отражающей организацию нуклеоидов в персистирующих и неперсистентных клетках.

1. Культура бактериальных клеток для микрофлюидной покадровой микроскопии
   1. Внесите 5 мл среды (3-[N-морфолин] пропансульфоновая кислота (MOPS) глицерин 0,4%, при необходимости с добавлением селективного антибиотика) с изолированной колонией в стеклянную пробирку (≥25 мл) и поместите пробирку в встряхивающий инкубатор, установленный при температуре 37 °C и 180 об/мин, на ночь (между 15 ч и 19 ч).
   2. На следующий день измерьте внешний диаметр₆₀₀ нм и разведите культуру в свежей среде, скорректированной по температуре (37 °C, глицерин MOPS 0,4%) в стеклянной пробирке до конечного наружного диаметра₆₀₀ нм ~0,001. Дайте культуре вырасти в течение ночи (от 15 до 19 часов) в встряхивающем инкубаторе при температуре 37 °C и 180 об/мин, чтобы на следующий день получить культуру с ранней экспоненциальной фазой.
2. Подготовка микрофлюидной пластины и покадровая микроскопия
   ЗАМЕТКА: Микрофлюидные эксперименты могут быть выполнены в коммерчески доступных микрофлюидных устройствах (как описано здесь) или в микрофлюидных системах собственного производства.
   1. Удалите консервирующий раствор (если он присутствует) из каждой лунки микрофлюидного планшета и замените его свежей питательной средой.
      ЗАМЕТКА: Если микрофлюидная пластина содержит выпускной колодец для отходов, консервационный раствор выпускного отверстия должен быть удален, но не заменен средой.
   2. Загерметизируйте микрофлюидную пластину с помощью системы коллектора, нажав кнопку «Уплотнение » или с помощью микрофлюидного программного обеспечения (сначала выберите «Инструмент», затем « Уплотнительная пластина»).
      ЗАМЕТКА: Чтобы герметизировать пластину, необходимо приложить равномерное давление к пластине и коллектору, вручную прижав пластину к коллектору. При правильном выполнении в интерфейсе ONIX2 должна появиться пометка «запечатано». Важно не оказывать давления на предметное стекло, чтобы избежать потенциального риска поломки коллектора.
   3. После запечатывания выполните первую последовательность грунтовки (нажмите « Запустить последовательность жидкостного грунта » в интерфейсе микрофлюидного программного обеспечения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность запуска жидкого грунта соответствует 5 минутам перфузии при 6,9 кПа для скважин 1-5, за которыми следуют 5 минут перфузии при 6,9 кПа для скважины 8 и заключительному раунду перфузии для скважины 6 в течение 5 минут при 6,9 кПа. Последовательность Run Liquid Priming позволяет удалить консервационный раствор, который все еще может присутствовать в каналах, соединяющих различные скважины.
   4. Инкубируйте планшет в термостатическом шкафу микроскопа при желаемой температуре (в данном случае 37 °C) в течение минимум 2 часов до начала микроскопической визуализации.
   5. Перед началом эксперимента запустите вторую последовательность жидкостного прайминга .
   6. Закройте микрофлюидную пластину, нажав «Запечатать» в интерфейсе программного обеспечения микрофлюидной жидкости. Замените среду в лунке 1 и лунке 2 на 200 мкл свежей среды, в лунке 3 на 200 мкл свежей среды, содержащей антибиотик (в данном случае офлоксацин (OFX) в концентрации 5 мкг^·мл-1), в лунке 4 и лунке 5 на 200 мкл свежей среды, в лунке 6 на 200 мкл свежей среды, и в лунке 8 с 200 мкл образца культуры (начиная со стадии 1.2), разбавленным до наружного диаметра₆₀₀ нм 0,01 в свежей среде.
   7. Запечатайте микрофлюидную пластину, как описано в шаге 2.2 , и поместите ее на объектив микроскопа внутри корпуса микроскопа.
      ЗАМЕТКА: Перед установкой микрофлюидной пластины обязательно нанесите каплю иммерсионного масла на объектив микроскопа.
   8. В микрофлюидном программном обеспечении нажмите « Загрузка клеток », чтобы разрешить загрузку клеток в микрофлюидную пластину.
      ЗАМЕТКА: Стадия нагружения ячейки включает 15 с перфузии при 13,8 кПа для скважины 8, затем 15 с перфузии при 27,6 кПа для скважин 6 и скважин 8 и заключительный раунд перфузии для скважины 6 в течение 30 с при 6,9 кПа. Плотность клеток в микрофлюидной пластине имеет решающее значение для эксперимента. Первая часть этого микрофлюидного протокола заключается в выращивании бактерий в течение 6 часов в свежей среде перед лечением антибиотиками. После 6 ч роста плотность клеток должна быть достаточной для обнаружения редких персистентных клеток (в условиях, использованных в данном исследовании, персистентные клетки генерируются с частотой 10⁻⁴). Если плотность клеток слишком высока, трудно различить отдельные клетки, что препятствует точному анализу отдельных клеток. Поскольку скорость роста напрямую зависит от среды, плотность клеток в полях микроскопии должна быть оценена до начала эксперимента.
   9. Установите оптимальный фокус с помощью режима проходящего света и выберите несколько областей интереса (ROI), где наблюдается соответствующий номер ячейки (до 300 ячеек на поле).
      ЗАМЕТКА: Выберите не менее 40 ROI, чтобы убедиться, что редкие персистентные клетки визуализированы.
   10. В программном обеспечении для микрофлюидики нажмите « Создать протокол». Запрограммируйте закачку свежей среды со скоростью 6,9 кПа в течение 6 ч (скважина 1-2), затем закачку среды, содержащей антибиотик, со скоростью 6,9 кПа в течение 6 ч (скважина 3) и, наконец, закачку свежей среды со скоростью 6,9 кПа в течение 20 ч (скважины 4-5).
       ЗАМЕТКА: Бактериальная культура, разбавленная до наружного диаметра₆₀₀ нм 0,01, позволяет бактериям расти в микрофлюидной камере в течение 6 часов, гарантируя, что клетки находятся в фазе экспоненциального роста. В зависимости от количества клеток, вводимых в микрофлюидное устройство на этапе загрузки (см. шаг 2.8), продолжительность фазы роста может быть адаптирована для получения до 300 клеток за один ROI. Поскольку персистенция является редким явлением, увеличение числа клеток на ROI улучшает возможность наблюдения за персистентными клетками. Однако количество клеток не должно превышать 300 ячеек на ROI, так как это делает анализ одиночных клеток утомительным.
   11. Выполняйте микроскопию в режиме покадровой съемки с одним кадром каждые 15 минут с использованием проходящего света и источника возбуждающего света для флуоресцентного репортера. Здесь был использован источник света с длиной волны 560 нм для сигнала mCherry (светодиод 580 нм при мощности 10% с фильтром 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] и экспозицией 100 мс для mCherry). Для визуализации клеток использовалось Zeiss-совместимое программное обеспечение Zen3.2.
3. Анализ изображений
   ЗАМЕТКА: Открытие и визуализация микроскопических изображений выполняются с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/). Количественный анализ изображений выполняется с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом ImageJ/Fiji и бесплатного плагина MicrobeJ (https://microbej.com). В этом протоколе использовалась версия MicrobeJ 5.13I(14).
   1. Откройте программное обеспечение ImageJ/Fiji на компьютере и перетащите изображения интервальной микроскопии Hyperstack на панель загрузки Fiji. Используйте >Цвет изображения > Сделать композитным чтобы объединить различные каналы гиперстека. Если каналы в эксперименте с интервальной съемкой не соответствуют нужному цвету (например, фазовый контраст отображается красным цветом, а не серым), используйте команды Изображение > Цвет > Упорядочить каналы , чтобы применить соответствующий цвет к каналам.
   2. Откройте плагин MicrobeJ и обнате бактериальные клетки с помощью интерфейса ручного редактирования. Удалите автоматически обнаруженные ячейки и вручную покадрово обведите интересующие их постоянные ячейки.
      ЗАМЕТКА: Для автоматического обнаружения отдельных ячеек можно использовать различные настройки. Здесь использовалось ручное детектирование, так как анализируемые персистентные клетки образуют длинные филаменты, которые редко обнаруживаются правильно с помощью автоматического детектирования.
   3. После обнаружения используйте значок «Результат» в интерфейсе ручного редактирования MicrobeJ, чтобы создать таблицу ResultJ. Сохраните файл ResultJ и используйте его для получения информации о различных параметрах, представляющих интерес в анализе отдельных клеток. В этом протоколе экспортировались средняя флуоресценция интенсивности HU-mCherry, длина клетки и площадь отдельных клеток.

Materials