$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Генерация зеленого флуоресцентного белка (GFP) с меткой циклическим di-GMP (c-di-GMP) Reporter штамм Pseudomonas aeruginosa
- Засейте 5 мл среды лизогенного бульона (LB) с одной колонией P. aeruginosa и инкубируйте в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин.
- Перелейте 2 мл ночной культуры в 200 мл свежей среды LB в колбу объемом 1 л и инкубируйте при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин.
- Контролируйте оптическую плотность на длине волны 600 нм (наружный диаметр600) каждые 30 минут, взяв образец объемом 1 мл из колбы и исследуя его с помощью спектрофотометра.
- Когда внешний диаметр600 достигнет 0,3 - 0,5, поместите 40 мл культуры в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
- Гранулируйте клетки центрифугированием при 8 000 об/мин в течение 10 минут при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 40 мл ледяного стерильного раствора сахарозы с концентрацией 300 мМ.
- Гранулируйте клетки второй раз центрифугированием, как описано на шаге 1.5, и повторно суспендируйте в 20 мл ледяного, стерильного, 300 мМ раствора сахарозы.
- В последний раз гранулируйте клетки центрифугированием, как описано на шаге 1.5, и повторно суспендируйте в 400 мкл ледяного, стерильного раствора сахарозы в дозе 300 мМ.
Примечание: Плотность клеток на этом этапе должна составлять примерно 1 x 10-11 колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл). - Охладите ячейки на льду в течение 30 минут, после чего они готовы к электропорации.
- Добавьте 1 мкл 0,2 мкг/мкл раствора плазмиды pCdrA::gfpC в 40 мкл электрокомпетентных клеток P. aeruginosa, приготовленных выше, в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, предварительно охлажденной на льду. Перемешайте суспензию и переложите ее в предварительно охлажденную электродную кювету с зазором 2 мм.
- Удалите влагу с внешней стороны кюветы с помощью папиросной бумаги и поместите кювету в камеру для образцов электропоратора. Импульсный с напряжением 2,5 кВ, емкостью 25 мкФ, сопротивлением 200 Ω.
- Снимите кювету и добавьте 1 мл LB medium. Затем перенесите клетки в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте в течение 2 часов при температуре 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин.
- Распределите 10 мкл, 50 мкл и 100 мкл аликвот культуры на стерильные LB-агаровые планшеты с добавлением ампициллина (в концентрации 100 мкг/мл) и инкубируйте планшеты при 37 °С в течение ночи.
- Подтвердите экспрессию GFP (возбуждение на длине волны 485 нм, излучение на длине волны 520 нм), исследуя планшет под флуоресцентным микроскопом со стандартным каналом GFP, и выберите одну колонию для инокуляции 5 мл LB. Инкубируйте в течение ночи, как описано в шаге 1.1. Смешайте 0,5 мл ночной культуры с 0,5 мл 50% глицерина в пробирке с завинчивающейся крышкой объемом 2 мл и храните при температуре -80 °C.
2. Подготовка закваски к инокуляции
- За два дня до скрининга нанесите штамм P. aeruginosa (содержащий плазмиду pCdrA::gfpC ) из исходного материала при температуре -80 °C на планшет LB-агар (с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг/мл), аккуратно распределив бактерии по планшету с помощью стерильной петли посева. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 °C.
- Вечером накануне скрининга инокулировать одну колонию P. aeruginosa из планшета в 10 мл среды LB (с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг/мл) в пробирке и инкубировать предкультуру в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин.
- В день показа подготовьте субкультуру из ночной предкультуры, разбавив ее сначала свежей средой LB до наружного диаметра600 1,0, а затем дополнительно разбавив 5% LB до наружного диаметра600 0,04 (соотношение 1:25).
Примечание: Общий объем инокулированной среды зависит от количества испытываемых планшетов. 5% LB получают путем разбавления 100% LB фосфатно-солевым буфером (PBS) до необходимой концентрации. Важно отметить, что среда (5% LB) обеспечивает конститутивную активацию pCdrA::gfpC у P. aeruginosa. - Добавьте в контейнер стерильную магнитную мешалку и перемешивайте культуру на магнитной мешалке с минимальной скоростью в течение 30 минут при комнатной температуре, позволяя бактериям акклиматизироваться к среде перед их распределением в 384-луночные планшеты.
3. Посев и инкубация 384-луночных планшетов, содержащих малые молекулы
Примечание: Стерильность и хорошие методы асептики имеют первостепенное значение для следующих этапов.
- Для приготовления положительного контроля (100% ингибирования) добавьте 20 мкл тобрамицина сульфата (25 мг/мл) в 10 мл (достаточно для 12 планшетов) субкультуры, приготовленной на Шаге 2.3, и осторожно перемешайте. Пипетка 40 мкл положительной контрольной культуры в лунки А23-Р23 (рис. 1).
- Для приготовления отрицательного контроля (0% ингибирования) добавьте 30 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) в 10 мл (достаточно для 12 планшетов) субкультуры, приготовленной на Шаге 2.3, и осторожно перемешайте. Пипетка 40 мкл культуры отрицательного контроля в лунки A24-P24 (рис. 1).
- Для каждой из пластин, штампованных малыми молекулами, инокулируйте объем 40 мкл разведенных за ночь культур (описанных на шаге 2.3) в лунки А1-Р22 (рис. 1).
Примечание: Этого можно добиться с помощью робота-манипулятора для работы с жидкостями. Из-за неоднородных свойств бактериальных культур важно поддерживать непрерывное и умеренное перемешивание, чтобы бактерии равномерно распределялись в среде во время дозирования. Для этого продолжайте помешивать акклиматизированную культуру с шага 2.4 с помощью магнита во время дозирования. - Запечатайте планшеты воздухопроницаемой крышкой и инкубируйте в течение 6 часов при температуре 37 °C.
Примечание: Воздухопроницаемое уплотнение имеет решающее значение для поддержания неизменных условий на всех 384 скважинах и предотвращения потенциального развития градиентов кислорода на пластине.
4. Измерение роста (OD600) и внутриклеточного уровня c-di-GMP (GFP)
- Примерно за 30 минут до спектрофотометрического измерения предварительно нагрейте считыватель пластин до 37 °C, чтобы избежать конденсации.
- Перед чтением аккуратно снимите воздухопроницаемую защитную пленку. Измерьте оптическую плотность на длине волны 600 нм с установкой 10 вспышек на лунку и временем установления 0,2 сек.
- Перед измерением флуоресценции выполните автоматическую регулировку усиления и фокусировки на основе лунки A24 (отрицательное управление) и установите целевое значение усиления на 75% (рис. 1).
- В программном обеспечении для управления считывателем пластин нажмите «Начать измерение» и перейдите на вкладку «Регулировка фокусировки и усиления/Идентификаторы пластин».
- Выберите ''Focus Adjust'' и ''Channel A'' справа на окне.
- Выберите «Регулировка усиления» и «Выбранная скважина» и введите «75» в качестве «Целевого значения». Наконец, выберите A24 в схеме расположения пластин, прежде чем нажать на кнопку «Начать регулировку». После того, как регулировка будет выполнена, нажмите «Начать измерение».
- Измерьте флуоресценцию от репортера GFP при максимумах возбуждения/излучения 485/520 нм с настройкой 10 вспышек на лунку и временем установления 0,2 сек.
- Соберите данные со всех исследованных пластин.
Примечание: Показания данных автоматически сохраняются по умолчанию программным обеспечением для управления считывателем пластин.- Чтобы просмотреть показания, нажмите на значок «Марс» в управляющем программном обеспечении, чтобы открыть пакет статистического анализа.
- Извлекайте данные с помощью «двойного щелчка» по интересующему номеру пластины, чтобы получить доступ к данным для анализа.
