Методика приготовления моноклональной бактериальной культуры

Аннотация

Источник: Lin, P., et al. Синтез микрокапсул вольфрамата натрия и молибдата натрия путем экскреции бактериальных минералов. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео демонстрируется приготовление моноклональной бактериальной культуры для производства минералов путем серийного разведения и выделения колоний на агаровой пластине. Встряхивая пластину стеклянными шариками, отдельные клетки пространственно разделяются, образуя генетически однородные колонии, которые затем переносятся в жидкие среды для роста. Отбирается культура с самой высокой мутностью, что указывает на самую плотную моноклональную популяцию и наибольший потенциал добычи полезных ископаемых.

Протокол

1. Приготовление стеклянных бусин

1. Поместите 100 стеклянных шариков диаметром 3 мм в лабораторный флакон объемом 100 мл, а затем плотно закройте крышкой.
2. Автоклавируйте содержимое при температуре 120 °C в течение 10 мин.
3. Дайте бутылке остыть до комнатной температуры, затем поместите ее в шкаф биобезопасности.

2. Приготовление лизогенного бульона (ЛБ)

1. Растворите 8 г порошка бульона LB-Lennox в лабораторном флаконе объемом 500 мл с 400 мл воды.
2. Перемешивайте содержимое магнитной мешалкой из политетрафторэтилена (ПТФЭ) в течение 20 минут, а затем плотно закупорьте крышкой.
3. Автоклавируйте содержимое при температуре 120 °C в течение 10 мин.
4. Дайте раствору остыть до комнатной температуры и поместите его в шкаф биобезопасности.
5. С помощью пипетки разлейте бульон в восемь центрифужных пробирок объемом 15 мл (по 12,5 мл каждая) в шкафу биобезопасности.
6. Разложите оставшийся бульон по трем лабораторным флаконам объемом 100 мл в биобезопасном шкафу (по 100 мл каждая). Плотно закройте три бутылки крышкой. Храните их в шкафу биобезопасности.

3. Культура водорослей шеванелла

1. Используйте криоконсервированный штамм глубокой заморозки.
2. В шкафу биобезопасности выберите 1 мл замороженного материала из замороженной пробирки с помощью шпателя из нержавеющей стали и поместите его в центрифужную пробирку, подготовленную на шаге 3.5.
3. Инкубируйте культуры в течение 24 ч в инкубаторе при температуре 37 °C.

4. Приготовление LB-Lennox (Бульон с агаром) Чашки Петри

1. Растворите две таблетки LB-Lennox (бульон с агаром) в лабораторном флаконе объемом 100 мл со 100 мл воды.
2. Перемешивайте содержимое с помощью магнитной мешалки из ПТФЭ в течение 20 минут, а затем плотно закупорьте крышкой.
3. Автоклавируйте содержимое при температуре 120 °C в течение 10 мин.
4. В шкафу биобезопасности вручную нанесите 100 мл раствора в 4 чашки Петри, следя за тем, чтобы каждая получила ~25 мл. Дайте раствору остыть до комнатной температуры.

5. Приготовление моноклональных бактерий

1. В шкафу биобезопасности промаркируйте три бутылки, приготовленные на шаге 2.6, #1, #2 и #3 соответственно.
2. Пипеткой введите 0,1 мл полученной бактериальной суспензии на шаге 3.3 во флакон #1. Закройте бутылку крышкой и покачивайте ее вручную в течение 1 минуты, чтобы получить однородный раствор.
3. Пипеткой введите 0,1 мл полученной бактериальной жидкости на шаге 5.2 во флакон #2. Закройте бутылку крышкой и покачивайте ее вручную в течение 1 минуты, чтобы получить однородный раствор.
4. Пипеткой нанесите 0,1 мл полученной бактериальной жидкости на шаге 5.3 во флакон #3. Закройте бутылку крышкой и встряхивайте ее вручную в течение 1 минуты, чтобы получить однородный раствор.
5. Нанесите жидкость из флакона #3 в 4 чашки Петри, приготовленные на шаге 4.4, объемом 0,02 мл каждая.
6. Выложите приготовленные на шаге 1.3 стеклянные бусины в 4 используемые чашки Петри, по 4 бусины в каждую посуду.
7. Закройте крышки посуды Петри и встряхивайте их вручную в течение 1 минуты.
8. Переверните чашки Петри вверх дном и выдерживайте в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 24 часов.

6. Размножение моноклональных бактерий

1. Возьмите 7 пробирок, подготовленных на шаге 2.5.
2. Выберите полученные моноклональные бактерии из 4 чашек Петри, приготовленных на шаге 5.8, с помощью шпателя из нержавеющей стали и поместите их в 7 пробирок отдельно.
3. Оставьте 7 пробирок в инкубаторе при температуре 37 °C на 24 часа.
4. Выберите тот, у которого наибольшее рассеяние света, используя визуальный колориметрический метод.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
LB (бульон Леннокса) с таблетками агара	Сигма-Олдрич	Л7075	1 таблетка на 50 мл бульона с агаром
LB (бульон Леннокса)	Сигма-Олдрич	Л3022-1КГ	Порошок LB (Lennox) 1 кг
Декстроза безводная	Реагент Нихон Шияку	ПЛ 78695	глюкоза
Центрообразующая трубка 50 мл	Сокол	14-432-22
Центрообразующая трубка 15 мл	Сокол	14-959-53А
Флакон лабораторный 100 мл	Дюран	21 801 24 5
Флакон лабораторный 500 мл	Дюран	21 801 44 5
Шпатель из нержавеющей стали	Химстекло	КГ-1981-10
Одноразовые мешалки из ПТФЭ	Рыбак	С68066
Пластиковые чашки Петри	Рыбак	S33580A
Инкубатор	Сделано заказчиком	Изготовление на заказ	нагревать до 40 °C или охлаждать до 18 °C с течением времени
Шкаф биобезопасности	Цзун Йен Ко., Лтд	ЗЫБХ-420	Здесь выполняются все процессы, связанные с бактериями
Автоклав	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., город Тайбэй, Тайвань, ROC	ТМ-329	нагреть до 120 °C в течение 10 мин