Синтез микрокапсул оксида металла с использованием металлвосстановительных бактерий

Аннотация

Источник: Lin, P., et al. Синтез микрокапсул вольфрамата натрия и молибдата натрия путем экскреции бактериальных минералов. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео показана процедура синтеза жестких микрокапсул оксида металла путем культивирования металлоредуцирующих бактерий с ионами металлов с последующей последовательной очисткой с помощью ультразвука, центрифугирования и промывки этанолом.

Протокол

ВНИМАНИЕ: Для проведения эксперимента используйте латексные перчатки, защитные очки и лабораторный халат. При использовании шкафа биобезопасности включите вентилятор шкафа и держите дверцу шкафа полузакрытой.

1. Приготовление стеклянных бусин

1. Поместите 100 стеклянных шариков диаметром 3 мм в лабораторный флакон объемом 100 мл, а затем плотно закройте крышкой.
2. Автоклавируйте содержимое при температуре 120 °C в течение 10 мин.
3. Дайте бутылке остыть до комнатной температуры, затем поместите ее в шкаф биобезопасности.

2. Приготовление лизогенного бульона (ЛБ)

1. Растворите 8 г порошка бульона LB-Lennox в лабораторном флаконе объемом 500 мл с 400 мл воды.
2. Перемешайте содержимое с помощью магнитной мешалки из ПТФЭ (политетрафторэтилена) в течение 20 минут, а затем плотно закройте крышкой.
3. Автоклавируйте содержимое при температуре 120 °C в течение 10 мин.
4. Дайте раствору остыть до комнатной температуры и поместите его в шкаф биобезопасности.
5. С помощью пипетки разлейте бульон в восемь центрифужных пробирок объемом 15 мл (по 12,5 мл каждая) в шкафу биобезопасности.
6. Разложите оставшийся бульон по трем лабораторным флаконам объемом 100 мл (по 100 мл каждая) в шкафу биобезопасности. Плотно закройте три бутылки крышками и храните их в шкафу биобезопасности.

3. Культура водорослей шеванелла

1. Используйте криоконсервированный штамм глубокой заморозки.
2. В шкафу биобезопасности выберите 1 мл замороженного материала из замороженной пробирки с помощью шпателя из нержавеющей стали и поместите его в центрифужную пробирку, подготовленную на шаге 3.5.
3. Инкубируйте культуры в течение 24 ч в инкубаторе при температуре 37 °C.

4. Приготовление LB-Lennox (Бульон с агаром) Чашки Петри

1. Растворите две таблетки LB-Lennox (бульон с агаром) в лабораторном флаконе объемом 100 мл со 100 мл воды.
2. Перемешивайте содержимое с помощью магнитной мешалки из ПТФЭ в течение 20 минут, а затем плотно закупорьте крышкой.
3. Автоклавируйте содержимое при температуре 120 °C в течение 10 мин.
4. В шкафу биобезопасности вручную нанесите 100 мл раствора в 4 чашки Петри, гарантируя, что каждая получит ~25 мл. Дайте раствору остыть до комнатной температуры.

5. Приготовление моноклональных бактерий

1. В шкафу биобезопасности промаркируйте три бутылки, приготовленные на шаге 2.6, #1, #2 и #3 соответственно.
2. Пипеткой введите 0,1 мл полученной бактериальной суспензии на шаге 3.3 во флакон #1. Закройте бутылку крышкой и покачивайте ее рукой в течение 1 минуты, чтобы получить однородный раствор.
3. Пипеткой введите 0,1 мл полученной бактериальной жидкости на шаге 5.2 во флакон #2. Закройте бутылку крышкой и покачивайте ее рукой в течение 1 минуты, чтобы получить однородный раствор.
4. Пипеткой нанесите 0,1 мл полученной бактериальной жидкости на шаге 5.3 во флакон #3. Закройте бутылку крышкой и встряхивайте ее рукой в течение 1 минуты, чтобы получить однородный раствор.
5. Нанесите жидкость из флакона #3 в 4 чашки Петри, приготовленные на шаге 4.4, объемом 0,02 мл каждая.
6. Выложите приготовленные на шаге 1.3 стеклянные бусины в 4 используемые чашки Петри, по 4 бусины в каждую посуду.
7. Закройте крышки посуды Петри и встряхивайте их вручную в течение 1 минуты.
8. Переверните чашки Петри вверх дном и выдерживайте в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 24 часов.

6. Размножение моноклональных бактерий

1. Возьмите 7 пробирок, подготовленных на шаге 2.5.
2. Выберите полученные моноклональные бактерии из 4 чашек Петри, приготовленных на шаге 5.8, с помощью шпателя из нержавеющей стали и поместите их в 7 пробирок отдельно.
3. Оставьте 7 пробирок в инкубаторе при температуре 37 °C на 24 часа.
4. Выберите тот, у которого наибольшее рассеяние света, используя визуальный колориметрический метод.

7. Приготовление бульона LB-Lennox с глюкозой и солью

1. Положите 10 г бульона LB-Lennox, 10 г NaCl и 10 г глюкозы в лабораторный флакон объемом 500 мл. Добавляйте воду до тех пор, пока объем не достигнет 450 мл.
2. Перемешивайте содержимое с помощью магнитной мешалки из ПТФЭ в течение 20 минут.
3. Автоклавируйте содержимое при температуре 120 °C в течение 10 мин.

8. Приготовление вольфрамата натрия

1. Нанесите 16,5 г вольфрамата натрия Na₂WO_{4,2H 2}O в лабораторный флакон объемом 100 мл с помощью шпателя из нержавеющей стали. Добавляйте воду до тех пор, пока объем не достигнет 50 мл.
2. Перемешивайте содержимое с помощью магнитной мешалки из ПТФЭ в течение 20 минут.
3. Автоклавируйте содержимое при температуре 120 °C в течение 10 мин.
4. В шкафу биобезопасности получите фильтрат через вакуумный стекловолоконный фильтр с порами 1 мкм.

9. Приготовление ЛБ с глюкозой, солью и вольфраматом натрия

1. В шкаф биобезопасности влейте вручную фильтрат, полученный на шаге 8.4, в раствор с глюкозой и солью, приготовленный на шаге 7.3.
2. В шкафу биологической безопасности с помощью пипетки нанесите 500 мл полученного раствора на этапе 9.1 в центрифужные пробирки объемом 10 x 50 мл.

10. Культивирование бактерий

1. В шкаф биобезопасности наберите жидкость, приготовленную на шаге 6.4, и добавьте ее с помощью пипетки в 10 пробирок, приготовленных на шаге 9.2, причем в каждую пробирку следует ввести 0,05 мл.
2. Инкубируйте 10 пробирок в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 120 часов.

11. Заготовка минералов БМЭ

1. Ультразвуковое воздействие на каждую из 10 трубок на шаге 9.2 при частоте 20 кГц и мощности 150 Вт в течение 1 часа.
2. Центрифугируйте пробирки при давлении 2,025 x g в течение 1 ч.
3. Удалите прозрачную жидкость из пробирок с помощью пипетки, добавьте воды, а затем повторите шаги 11.1 и 11.2 еще раз.
4. Удалите прозрачную жидкость из пробирок с помощью пипетки, добавьте спирт, а затем ультразвуком обеспечьте их ультразвуковой мощностью 20 кГц мощностью 150 Вт в течение 1 ч.
5. Центрифугируйте пробирки при давлении 2,025 x g в течение 1 ч.
6. Повторите шаги 11.4 и 11.5 еще раз
7. Соберите минералы BME, удалив прозрачную жидкость из пробирок с помощью пипетки; После этого немедленно закройте пробирки крышкой, не запуская процесс сушки.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бульон LB(Lennox) с таблетками агара	Сигма-Олдрич	Л7075	1 таблетка на 50 мл бульона с агаром
Бульон LB (Леннокс)	Сигма-Олдрич	Л3022-1КГ	Порошок LB (Lennox) 1 кг
Декстроза безводная	Реагент Нихон Шияку	ПЛ 78695	глюкоза
Натрия Таффрат	Реагент Нихон Шияку	ПЛ 76050	Na2WO4 · 2H2O
Хлорид натрия	Реагент Нихон Шияку	ПЛ 68131	NaCl
Этанол 99,5%	Акрос органика	AC615090040	CH3CH2OH
Вода	Сделано в нашем университете		Деионизированная вода
Автоклав	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., город Тайбэй, Тайвань, ROC	ТМ-329	нагреть до 120 °C в течение 10 мин
Центрифуга	Лабораторная система Digit System, город Нью-Тайбэй, Тайвань, ROC	DSC302SD	центрифуга в 2025 x g
-80 °C Холодильник	Панасоник	МДФ-У3386С	Использовать для глубокой заморозки сорта криоконсерва
Ультразвуковой гомогенизатор Ультразвуковой ультразвуковой аппарат Процессор Разрушитель ячеек	Ленокс	ИБП-150	частота 20 кГц мощность 150 Вт
Инкубатор	Сделано заказчиком	Изготовление на заказ	нагревать до 40 °C или охлаждать до 18 °C с течением времени
Встряхивающие ванны с взаимным встряхиванием	Кингтек Сайентиал Ко., Лтд	ВБС-Л
Цифровая нагревательная пластина для перемешивания	Корнинг	#6797-620Д	использование с магнитной мешалкой из ПТФЭ
Шкаф биобезопасности	Цзун Йен Ко., Лтд	ЗЫБХ-420	Здесь выполняются все процессы, связанные с бактериями
Центрообразующая трубка 50 мл	Сокол	14-432-22
Центрообразующая трубка 15 мл	Сокол	14-959-53А
Флакон лабораторный 100 мл	Дюран	21 801 24 5
Флакон лабораторный 500 мл	Дюран	21 801 44 5
Шпатель из нержавеющей стали	Химстекло	КГ-1981-10
Одноразовые мешалки из ПТФЭ	Рыбак	С68066
Пластиковые чашки Петри	Рыбак	S33580A
Водоросль Shewanella	Предоставлено автором #3	Предоставлено автором #3