$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Планирование эксперимента
- Начинают лечение животных путем перорального зондирования, после 2 дней акклиматизации. Используйте шприц с иглой для полости рта. Обрабатывайте 16 крыс суспензией Bacillus subtilis BSB3 (по 1 мл на крысу) два раза в день в течение двух дней (группа B. subtilis). Обрабатывайте 16 крыс фосфатно-соевым буфером, PBS (1 мл на крысу), два раза в день в течение двух дней (группа PBS) (Рисунок 1).
- После обработки разделите каждую группу (по 8 крыс в группе): Группа 1 - контроль (PBS/без стресса), Группа 2-B. subtilis (B. subtilis / без стресса), Группа 3 - стресс (PBS/тепловой стресс) и Группа 4 - B. subtilis + стресс (B. subtilis/тепловой стресс).
- Измерьте ректальную температуру каждой крысы с помощью электронного цифрового термометра. Крыс 1 и 2 групп держать при комнатной температуре 25 мин. Поместите животных групп 3 и 4 в климатическую камеру при температуре 45 °C и относительной влажности 55% на 25 минут.
- После этого измерьте ректальную температуру каждой крысы во всех группах с помощью электронного цифрового термометра. Поместите всех животных при комнатной температуре на 4 часа.
- Обезболивайте крыс изофлураном (2 - 4%) в герметичной банке для анестезии и наблюдайте до тех пор, пока крысы не будут глубоко обезболены (отсутствие реакции на защемление пальцев ног). Усыпляйте крыс путем быстрого обезглавливания с помощью гильотины.
- Соберите кровь из туловища каждой крысы (15 - 16 мл) с помощью апирогенных пипеток в апирогенные пробирки для получения сыворотки и немедленно возьмите образцы крови (7 мкл от каждой крысы) с помощью пипетки для микроскопического исследования.
- Поместите пробирки с кровью в холодильник минимум на 30 минут, чтобы обеспечить свертывание. Центрифугируйте пробирки при температуре 20 °C, 7 000 x g в течение 10 минут и быстро удалите сыворотку с помощью пипетки. Аликвотировать сыворотку, полученную от каждой крысы, в объеме 50 мкл и хранить при -20 °С до проведения анализа.
2. Хирургическая процедура
- Стригите/подрежьте весь мех с живота и грудной клетки нижней части туши электрическими ножницами. Поместите тушку в стерильный шкаф и обработайте бритую поверхность тушки 70% спиртом.
- С помощью стерильного скальпеля сделайте разрез по средней линии живота. Удалите печень, брыжеечные лимфатические узлы, селезенку и тонкую кишку у каждой крысы с помощью стерильного пинцета.
3. Анализ бактериальной транслокации
- Поместите каждый образец печени, брыжеечных лимфатических узлов и селезенки в предварительно взвешенные стерильные пробирки и взвесьте. Рассчитайте вес образца как разницу между весом пробирки с пробой и весом пустой пробирки.
- Добавьте в пробирку стерильный PBS для получения разведения образца в соотношении 1:10 (вес на объем, w/v) и гомогенизируйте каждый образец с помощью гомогенизатора стерильной стеклянной ткани для получения однородной суспензии.
- Проводите серийные разведения (от 10-1 до 10-4) каждого образца в стерильном PBS. Нанесите 0,1 мл всех разведений каждой ткани на поверхность Мак-Конки и 5% кровяного агара и кровяного агара Brucella с гемином (0,005 г/л) и витамином К1 (0,01 г/л).
- Аэробно инкубировать планшеты Мак-Конки и 5% кровяного агара, а также кровяные агаровые планшеты Brucella в анаэробных условиях при 37 °С.
- Подсчитайте колонии аэробных бактерий через 24 часа и колонии анаэробных бактерий через 48 часов инкубации с помощью счетчика колоний. Выразите результаты в виде количества колониеобразующих единиц (КОЕ) в грамме ткани.
