Производство и аэрозольное осаждение спор Bacillus subtilis

Аннотация

Источник: Fuchs, F.M., et al. Исследование вредного влияния стерилизации плазмы низкого давления на выживаемость спор Bacillus subtilis с помощью микроскопии живых клеток. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видеоролике демонстрируется производство, очистка и осаждение спор Bacillus subtilis с помощью аэрозолей для создания однородного монослоя, что позволяет использовать его для анализа прорастания спор, жизнеспособности или реакции на стресс с помощью микроскопии.

Протокол

1. Производство и очистка спор Bacillus subtilis

1. Для производства спор перенесите 5 мл на ночь культуры соответствующего штамма B. subtilis , дополненного соответствующими антибиотиками, в 200 мл жидкой среды для спороношения Шеффера двойной концентрации (на литр 16 г питательного бульона, KCl (хлорид калия) 2 г, 0,5 г MgSO₄*7 H₂O (гептагидрат сульфата магния), 2 мл 1 M Ca(NO₃)₂ (кальциевая селитра), 2 мл 0,1 М MnCl₂ *• 4 H₂O (тетрагидрат хлорида марганца), 2 мл 1 мМ FeSO₄ (сульфат железа), 2 мл 50% (w/v) глюкозы18) и культивируют его с интенсивной аэрацией при 37 °C в течение 72 ч или до тех пор> пока 95% культуры не проспорует. Используются споры следующих штаммов: B. subtilis PY79 (дикий тип) B. subtilis PY79ΔrecA::neo (дефицит белка репарации ДНК RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp::cat (RecA слитый с желтым флуоресцентным белком [YFP]).
2. Соберите споры центрифугированием в течение 15 минут при плотности 3000 x g в пробирках объемом 50 мл и очистите образцы путем повторной промывки (до 15 раз) с использованием стерильного дистиллированного_H2Oи проверьте чистоту и состояние прорастания с помощью фазово-контрастной микроскопии. Убедитесь, что споровые суспензии состоят из спор с яркой фазой (> 99%) и не содержат вегетативных клеток (палочек), пророщенных спор (черный/серый цвет) и клеточных остатков; В противном случае дальнейшие эксперименты с микроскопией могут быть нарушены. Промойте образец до тех пор, пока не будет достигнута желаемая чистота.
3. Определите титр спор путем выделения 50 мкл 10-кратных серийных разведений на LB (luria-bertani)-агаре (т.е.: используйте образец 30 мкл + 270 мкл стерильной воды для разведения в соотношении 1:10). Возьмите 30 мкл от конкретного разведения до 270 мкл H₂O для разведения 1:100 и т. д.) для расчета КОЕ (колониеобразующих единиц) и инкубируйте планшеты при 37 °C в течение ночи. После определения КОЕ отрегулируйте пробу до^10-9 спор на мл путем концентрирования или разбавления стерильной водой.

2. Пробоподготовка спор Bacillus subtilis , осажденных аэрозолем

ЗАМЕТКА: Накопление и перекрытие спор может привести к эффекту затенения во время лечения, что в конечном итоге приводит к фальсификации кинетики инактивации. Чтобы свести к минимуму эту проблему, подготавливайте образцы спор методом аэрозольного осаждения. Вкратце, управляйте высокоточным двухкомпонентным соплом с электрическим таймером, который регулирует производительность жидкости в соответствии с потоком газа-носителя под давлением (здесь N₂). Диспергируйте впрыскиваемый жидкий образец через выходное отверстие сопла с помощью потока газообразного азота.

1. Поместите носитель образца в виде стерилизованных микроскопических стекол (для кинетики выживания) или круглых покровных стекол диаметром 25 мм (для флуоресцентного отслеживания процессов репарации ДНК/cLSM; конфокальная лазерная сканирующая микроскопия) внутрь аэрозольного распылителя с электрическим приводом в соответствии с соплом. Используемая концентрация спор должна в сто раз превышать желаемую конечную концентрацию.
2. Перенесите 1 мл культуры спор на вход жидкости форсунки и начните процесс распыления продолжительностью 0,1 с под давлением 1,3 бар. Распыленная споровая суспензия (1 x 10⁷) образует тонкую пленку на микроскопическом предметном стекле, которая быстро высыхает в течение нескольких секунд, образуя равномерно распределенный монослой спор. Обработанные носители образцов хранить в стерильном контейнере при комнатной температуре.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сопло с двумя веществами (модель 970-8)	Шлик	14,404	230 В, 50 Гц, D 4.484/8, диаметр отверстия 0.8 мм
Лурия Бертани Медиум	Сигма Олдрич	70122-100Г
Трубчатые соединители	Festo	н/д	Г 1/8
Стеклянные предметные стекла	ВВР	48300-026
Камера с ячейками Attofluor	Menzel, Fisher Ref.	3406816	d=25 мм, круглый
Гептагидрат сульфата магния	Сигма Олдрич	13152
Кальциевая селитра	Сигма Олдрич	202967
Тетрагидрат хлорида марганца	Сигма Олдрич	244589
Сульфат железа	АпплиХим	13446-34-9
Глюкоза	Мерк	215422
Хлористый калий	Сигма Олдрич	П9541-500Г
Питательный бульон (NB)	Мерк	105443
Лурия-Бертани (LB)	Мерк	110283
96-луночная пластина	ТермоФишер	243656