Анализ жизнеспособности микрокистоза энегнойной палочки с помощью проточной цитометрии

Аннотация

Источник: Чепмен, И. Д., и др., Оптимизация молекулярного зонда для определения смертности клеток в фотосинтезирующем организме (Microcystis aeruginosa) с использованием проточной цитометрии. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео демонстрируется метод различения живых и мертвых клеток Microcystis aeruginosa путем сочетания флуоресцентного зондового мечения с проточным цитометрическим анализом фикоцианиновой автофлуоресценции и сигнала зонда.

Протокол

1. Оптимизация поглощения молекулярных зондовых клеток

1. Соберите половину культуры M. aeruginosa в экспоненциальной фазе и используйте ее в качестве «живого» контроля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, разведенные из культуры высокой плотности непосредственно до экспоненциальной фазы, могут повлиять на результаты оптимизации за счет оборота мертвых клеток по сравнению с культурами, инокулированными с начальной фазы задержки/индукции.
2. Подготовьте вторую половину в качестве «мертвого» контроля, используя такие методы, как 70% этанол, нагревание образцов при 60 ^°C в течение 1 часа, параформальдегид или 4% формальдегид в течение 30 минут. Проверьте изменения в микроокружении образцов (например, pH).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Положительный, убитый теплом, «мертвый» контроль у M. aeruginosa отличается от «живого» образца снижением сигналов фикоцианина. Вызывание смертности другими методами может не привести к такому же результату и будет варьироваться в зависимости от вида.
3. Настройте смешанные выборки, используя различные соотношения «живых» и «мертвых» образцов (например, 0%, 25%, 50%, 100%).
4. Дезагрегируйте образование колоний с помощью вортекса или ультразвука и проверьте pH.
5. Выберите лазер с длиной волны 488 нм наряду с детекторами, которые могут регистрировать флуоресценцию от зеленого (флуоресцентный канал 1 или FL1, 530 ± 15 нм) и оранжевого (флуоресцентный канал 2 или FL2, 585 ± 20 нм) зондов нуклеиновых кислот, а также от лазера 640 нм для регистрации сигналов фикоцианина через соответствующий детектор.
   Примечание: При связывании с ДНК зеленый зонд нуклеиновых кислот имеет приблизительную длину волны возбуждения флуоресценции 504 нм и максимумы излучения 523 нм, в то время как оранжевый зонд нуклеиновых кислот имеет длину волны возбуждения 547 нм и максимумы излучения 570 нм. Твердотельный лазер на ионах аргона с длиной волны 488 нм может быть использован для возбуждения обоих молекулярных зондов, однако зеленый лазер (до 547 нм) будет производить более высокую оранжевую флуоресценцию.
6. В качестве отправной точки введите молекулярный зонд в концентрации, рекомендованной производителем, в 50% «живой» и 50% «мертвой» культуры и инкубируйте в темноте.
7. Выберите новую ячейку данных, поместите выборку под порт ввода образца (SIP) с пороговыми значениями и триггерами, которые уменьшат фоновый шум (FSC-H или высота прямого рассеяния, 80 000).
8. Создание плотностного графика с параметрами FSC-H и SSC-H (высота бокового рассеяния) и трех гистограмм. Одна гистограмма с использованием соответствующего канала оптического детектора молекулярного зонда (FL1 или 2), одна для обнаружения излучения фикоцианина (высота флуоресцентного канала 4 или FL4-H), а другая, FSC-H, все на логарифмической шкале.
9. Образцы M. aeruginosa инкубируют с зондами нуклеиновых кислот в темноте в течение 60 минут, записывая данные в отдельные ячейки в различные моменты времени (1, 5, 10, 15, 30 и 60 минут).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При корректировке таких параметров, как pH, уточните у производителей потенциальные реакции от определенных химических веществ (для тестируемых зондов нуклеиновых кислот буфер не может содержать фосфаты или высокие уровни одновалентных или двухвалентных катионов, так как связывание с ДНК будет снижено).
10. Примените программный вентиль для включения только гистограммы FSC-H (320 000 - 1 500 000) для размера клетки целевого организма в соответствующую гистограмму канала флуоресцентного зонда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации, используемые в данном протоколе, составляли 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 и 100 мкМ, которые могут быть изменены путем увеличения или уменьшения объема образца M. aeruginosa или исходного исходного исходного раствора нуклеиновых зондов.
11. В канале флуоресцентного зонда примените еще один включительный программный вентиль к самому высокому пику гистограммы (зеленый FL1-H, 240 000 - 1 650 000, оранжевый FL2-H, 30 000 - 165 000) и затем закрутите эту положительную флуоресценцию зонда в график плотности.
12. Выполните шаги 3.1 - 3.11 со 100% "живыми", 100% "мертвыми" и всеми образцами смешанных культур, регулируя концентрации молекулярных зондов (например, от x 0,1 до x 10) и/или уровни температуры и pH, если это необходимо.
13. Сравните количество положительных сигналов флуоресценции молекулярных зондов с исходной плотностью «мертвых» клеток (взятой из половины общего количества FSC-H или 100% «мертвой» культуры), чтобы найти общий процент клеток, окрашенных зондами нуклеиновых кислот.
14. Делайте это для каждого периода времени в пределах каждой концентрации, чтобы найти оптимальный протокол для наибольшего процента поглощения клеточного нуклеинового зонда без неспецифического окрашивания (используйте средства в однофакторном дисперсионном анализе, ANOVA или одностороннем дисперсионном анализе Краскела-Уоллиса, если данные непараметричны).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Цианобактерии Медиа	Сигма-Олдрич	К3061-500МЛ	BG-11 Пресноводный концентрированный раствор (разбавление х50)
Обеззараживающая жидкость	BD Biosciences	653155	Работайте в течение 2 минут, если на выходе более 12 событий в секунду на быстром скорости или при скорости потока 66 мкл/мин. Затем 2 мин оболочки H2O.
Проточный цитометр	BD Biosciences	по запросу	BD Accuri C6
СИТОКС Грин	Технологии Life	С7020	Окрашивание нуклеиновой кислотой – 5 мМ раствор в ДМСО
SYTOX Оранжевый	Технологии Life	С11368	Окрашивание нуклеиновой кислотой – 5 мМ раствор в ДМСО