Оценка антимикробной активности вариантов низина с помощью диффузионного анализа в агаровой скважине

Аннотация

Источник: Никлинг, Д. Х., et.al. Антимикробные пептиды, полученные путем селективного включения под давлением неканонических аминокислот. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется агаровый хорошо диффузионный анализ, используемый для оценки антимикробной активности вариантов низина. Он показывает, как Lactococcus lactis , экспрессирующий мембраносвязанную пептидазу NisP, активирует предшественники низина, вырабатываемые в E. coli, что приводит к гало ингибирования роста. Размер этих ореолов отражает биологическую активность каждого варианта низина.

Протокол

1. Тест на антимикробную активность

1. Приготовление пластин GM17-агар в стерильных условиях
   1. В течение ночи готовят культуру индикаторного штамма L. lactis NZ9000, несущего плазмиду pNG nisPT при 30 °C в бульоне M17 с 1% (w/v) глюкозы (=GM17) и 5 мкг/мл хлорамфеникола.
   2. Измерьте наружный диаметр₆₀₀, инокулируйте свежую среду до наружного диаметра₆₀₀ = 0,1 и инкубируйте до наружного диаметра₆₀₀ = 0,4-0,6. Затем поставьте колбу на лед.
      ЗАМЕТКА: Каждое измерение наружного диаметра₆₀₀ будет потреблять объем культуры. Имейте в виду, что для каждой анагеровой пластины для анализа потребуется 1 мл бактериальной культуры. При необходимости соответственно увеличьте объем жидкой культуры.
   3. Для получения 1,5% агара отвесьте 4,5 г агара в стеклянной бутылке. Добавьте 300 мл ddH₂O, перемешайте и автоклав.
   4. Приготовьте 2х бульон М17 (двукратно концентрированный) в 300 мл ддН₂О и автоклав.
   5. Смешайте 25 мл 2x M17 бульона, содержащего 10 мкг/мл хлорамфеникола и 2% глюкозы, с 1 мл л. lactis preculture (4% v/v).
   6. Добавьте 25 мл расплавленного 1,5% агара (только что автоклавированного или нагретого в микроволновой печи).
      ЗАМЕТКА: Перед этим дайте бутылке остыть на ощупь (около 50 °C). Это необходимо, так как L. lactis является мезофильным организмом, чувствительным к высоким температурам.
   7. Налейте раствор в большую чашку Петри. Сушите тарелки в течение 10-15 минут.
   8. Простерилизуйте концы стеклянной пастеровской пипетки на пламени. Подождите, пока он остынет, затем используйте широкий конец для создания отверстий в затвердевшем GM17-агаре.
2. Подготовка образцов
   1. Возьмите 1 мл экспрессионных культур E. coli в маркированную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте в течение 3 минут при 7000 x g. Отсадите оставшуюся среду и ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл Na-P (50 мМ буфер фосфата натрия, pH 7,4 изготовлен из 0,5 М дигидрофосфата натрия и 0,5 М динатрия гидрофосфата).
   2. Обработайте образцы ультразвуком на льду. Погрузите кончик зонда ультразвукового аппарата в клеточную суспензию. Установите ультразвуковой аппарат на амплитуду 30 % с импульсом 1 с включенным и 5 с выключенным на 3 мин.
   3. Центрифугируйте клеточный лизат в течение 10 мин при давлении 13 000 x g до гранулированных остатков клеток. Перенесите надосадочную жидкость в новую реакционную пробирку на льду.
   4. Разбавляют и нормализуют надосадочную жидкость клеточного экстракта до 1 мл OD₆₀₀ = 0,6, относительно плотности собранных клеток, с Na-P.
3. Тест на активность
   1. Добавьте 40 мкл каждого нормализованного образца в отверстие индикаторной агаровой пластины (рис. 1). Используйте хлорамфеникол в концентрации 400 мкг/мл в качестве антибактериального контрольного соединения. Используйте буфер элюирования в качестве отрицательного контроля. Подождите, пока все образцы распыляются в агар. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 30 °C.
   2. Сфотографируйте агаровые пластины с помощью планшетного сканера или цифровой камеры. Размеры ореола ингибирования роста можно измерить вручную или с помощью ImageJ.

Результаты

Рисунок 1. Анализ антимикробной активности лизатов клеток, содержащих варианты низина, полученных с помощью SPI с аналогами пролина. Сравнение вариантов низина с рекомбинантными образцами дикого типа. Вс...

Материалы