Приготовление искусственной мокроты среды для имитации муковисцидоза мокротой легких ex vivo

Аннотация

Источник: Vieira, J., et al. Проектирование и разработка модели для изучения влияния дополнительного кислорода на микробиом дыхательных путей при муковисцидозе. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео демонстрируется приготовление искусственной среды мокроты, которая имитирует вязкость, питательный состав и pH мокроты легких при муковисцидозе. Полученная среда обеспечивает физиологически значимую платформу для исследований ex vivo.

Протокол

1. Приготовление искусственной среды для удаления мокроты

ЗАМЕТКА: Приведенные здесь количества относятся к производству 1 л готовой искусственной среды мокроты и предполагают использование конкретных реагентов, перечисленных в таблице материалов. Цифры должны быть скорректированы на другие объемы или на использование других реагентов, чтобы обеспечить тот же конечный продукт. Целевые концентрации приведены в таблице 1 .

1. Искусственная смесь мокроты (ASCM)
   ЗАМЕТКА: ASCM составляет 25% от конечного объема среды. Он устойчив к хранению и может быть приготовлен навалом или заранее. Если вы готовитесь к последующему использованию, откройте химическую смесь в автоклаве и безопасно храните ее при комнатной температуре.
   1. Смешайте составляющие химические исходные растворы.
      1. Подготовьте 1 М бульон NaCl: Добавьте 58,44 г NaCl на литр стерильной воды.
      2. Подготовьте 1 М запаса KCl: Добавьте 74,55 г KCl на литр стерильной воды.
      3. Приготовьте 1 М MgSO₄ бульона: Добавьте 246,47 г MgSO₄·7H₂O на литр стерильной воды, или 120,37 г безводного MgSO₄ на литр стерильной воды.
      4. Подготовьте 1 м запаса глюкозы: добавьте 180,16 г глюкозы на литр стерильной воды.
   2. Автоклав-стерилизуйте химические стоковые растворы, а также пустой флакон объемом 250 мл. Выполняйте этапы автоклавирования при стандартных значениях не менее 121 °C и 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 30 минут.
   3. Добавьте 80,59 мл стерильной воды в пустую бутылку объемом 250 мл.
   4. Добавьте в смесь 152,30 мл 1 М притока NaCl.
   5. Добавьте в смесь 15,8 мл бульона 1M KCl.
   6. Добавьте в смесь 610 μл 1 M MgSO₄ бульона.
   7. Добавьте в смесь 700 μл 1 М глюкозы.
2. Искусственная смесь муцина мокроты (ASMM)
   ЗАМЕТКА: ASMM составляет 50% от конечного объема среды. Убедитесь, что он приготовлен в тот же день, что и конечная средняя партия.
   1. Добавьте 450 мл стерильной воды в пустую бутылку объемом 1 л.
   2. Добавьте во флакон 50 мл 10-кратного фосфатно-солевого буфера (PBS).
   3. Добавьте в бутылку одноразовую магнитную мешалку.
   4. Автоклав бутылки с PBS и мешалкой.
   5. Отмерьте 10 г порошка муцина и добавьте его в ПБС.
   6. Энергично встряхните бутылку для предварительного перемешивания.
   7. Поставьте бутылку на горячую плиту с помощью магнитной мешалки. Установите огонь на средне-сильный, ориентируясь на 50 °C, и скорость перемешивания на 1100 об/мин. Увеличивайте скорость постепенно, чтобы стержень не слетел с магнита.
      1. Дайте нагреться и помешивайте в течение 15 минут.
      2. Возьмите бутылку в термостойкие перчатки. Наблюдайте, чтобы проверить, не оседает ли порошок муцина из раствора.
      3. Если порошок муцина растворен не полностью, верните бутылку на огонь/мешалку с 5-минутными интервалами до полного растворения.
   8. Дайте муциновой смеси остыть до комнатной температуры.
3. Искусственная биологическая смесь мокроты (ASBM)
   ЗАМЕТКА: ASBM составляет 25% от конечного объема среды. Готовьте его в тот же день, что и конечную среднюю партию, и в отличие от других смесей, не подвергайте его компоненты воздействию тепла.
   1. Разморозьте 100-кратный запас витаминов в холодильнике при температуре 4 °C или на льду. ​
      ЗАМЕТКА: Предварительно разделите запас витаминов на 10 мл аликвот, чтобы свести к минимуму количество циклов замораживания/размораживания.
   2. Добавьте 124,24 мл стерильной воды в пустую автоклавную бутылку объемом 250 мл.
   3. Добавьте в смесь 25,76 мл 50-кратного запаса незаменимых аминокислот.
   4. Добавьте в смесь 80,14 мл 100x запасных заменимых аминокислот.
   5. Добавьте в смесь 10 мл (размороженного) 100-кратного витаминного запаса.
   6. Добавьте в смесь 1 мл 1000x микропримесей металлов.
   7. Добавьте в смесь 8,33 мл 30% эмульсии яичного желтка.
   8. Добавьте в смесь 400 μл 10 г/л ферритина.
   9. Хорошо перемешайте раствор с помощью ручного встряхивания.
4. Искусственная среда мокроты (АСМ)
   1. Добавьте 250 мл ASCM в бутылку объемом 1 л, содержащую ASMM.
   2. Добавьте 250 мл ASBM в бутылку среднего размера.
   3. Титруйте среду с помощью основного буфера MOPS (1 М) до достижения pH 6,3 на бумаге с узким диапазоном pH. Перед титрованием смесь среды будет слишком кислой.
   4. Полученную искусственную среду мокроты охладите при температуре 4 °C до тех пор, пока она не будет готова к фильтрации.
   5. Чтобы начать процесс фильтрации, переведите 200 мл нефильтрованной искусственной среды мокроты в вакуумную фильтрацию с фильтром размером пор 0,22 мкм.
   6. Подключите систему фильтрации к вакуумному насосу, включите вакуумный насос, установите его на 70 мбар, а затем поместите камеру на орбитальный шейкер с встряхиванием при 90 об/мин в холодном помещении при температуре 4 °C.
      1. Добавьте еще 150 мл среды, так как заметное количество фильтруется. Для полного фильтрования 1 л среды требуется 1-2 дня.
      2. Повторите то же самое с дополнительными камерами, пока вся среда не будет отфильтрована.
         ЗАМЕТКА: Старайтесь не фильтровать более 350 мл среды через тот же фильтр 0,22 мкм, так как со временем муцин засорит фильтр.
   7. Отфильтрованную искусственную мокроту охладите при температуре 4 °C до готовности к использованию. Используйте ASM в течение одного месяца после подготовки для достижения наилучших результатов.

Таблица 1: Рецептура искусственной среды мокроты получена из обзора литературы. (Колонка 1) Реагенты и ключевые значения в рецептуре искусственной мокроты. (Колонки 2-7) Сравнение рецептов из дошедшей до нас литературы. (Колонки 8-9).

Столбец 1		Колонка 2	Столбец 3	Колонка 4	Колонка 5	Колонка 6	Колонка 7	Колонка 8	Колонка 9
Ценность		Комсток	Киршнер	Шрирамулу	Паломник	Флинн	Галлагер	Лай	Источник
Муцин		2% по массовому объему	0,5% по объему	0,5% по объему	-	1% по мас.%	2% по массовому объему	1% по мас.%	Флинн
Хлорид натрия		85,5 мМ	85,5 мМ	85,5 мМ	66,6 мМ	89,8 мМ	85,5 мМ	152,3 мМ	Лапьер
Хлористый калий		29,5 мМ	29,5 мМ	29,5 мМ	15,8 мМ	-	2,95 мМ	15,8 мМ	Паломник
Сульфат магния		-	-	-	0,6 мМ	1 мМ	1 мМ	0,61 мМ	Паломник
Сульфат железа		-	-	-	0,0036 мМ	-	-	-	-
Нашатырь		-	-	-	2,3 мМ	60 мМ	-	-	-
Монокалийфосфат		-	-	-	2,5 мМ	60 мМ	-	-	-
Глюкоза		-	-	-	3,2 мМ	13 мМ	40 мМ	0,7 мМ	Самбек
Лактат		-	-	-	9 мМ	-	-	-	-
Незаменимые аминокислоты		В 14,45 раза	0,25 г/л	0,25 г/л	на кислоту	В 0,5 раза	В 0,375 раза	В 1,29 раза	Паломник
Заменимые аминокислоты		В 28,9 раза	0,25 г/л	0,25 г/л	на кислоту	В 0,25 раза	В 0,5 раза	В 8,01 раза	Паломник
Витамины		-	-	-	-	-	1x	1x	Галлагер
Следы металлов		-	-	-	-	1x	1x	1x	Флинн
Желток		0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	Киршнер
Ферритина		0,0003 г/л	-	-	-	-	0,0004 г/л	0,0004 г/л	Галлагер
ДНК спермы лосося		1,4 г/л	4 г/л	4 г/л	-	-	1,4 г/л	-	-
ДПТА		-	-	0,0059 г/л	-	-	-	-	-
pH		-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	Лапьер
Хранение		0	4°	-	-	4°	4°	4°	Киршнер
Стерилизация		Автоклав	Фильтр	Автоклав	-	Автоклав	Автоклав	Фильтр	Киршнер

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Раствор витаминов BME (100x)	МиллипорСигма	В6891	Концентрированный раствор добавок витаминов.
Обжимной механизм, 30 мм	DWK Медико-биологические науки	224307	Обжимной аппарат для крепления алюминиевых уплотнителей к флаконам с сывороткой.
D-(+)-глюкоза	МиллипорСигма	Г7021	Твердый порошок глюкозы (кстровращающий изомер).
Мембранный насос ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Вакуумный насос для вакуумной фильтрации.
Эмульсия из яичного желтка	HiMedia	ФД045	Стерильная эмульсия из 30% яичного желтка в физрастворе.
Ферритин, катионизированный из селезенки лошади	МиллипорСигма	Ф7879	Раствор ферритина (белка, накапливающего железо).
Безопасная горелка Бунзена FIREBOY plus	Integra Biosciences	144000	Горелка Бунзена с пользовательским интерфейсом и функциями безопасности.
Бумага для измерения pH Hydrion (1,0–14,0)	Лаборатория Micro Essential	94	Бумага для измерения pH в диапазоне 1,0–14,0.
Бумага для измерения pH Hydrion (4,0–9,0)	Лаборатория Micro Essential	55	Бумага для измерения pH в диапазоне 4,0–9,0.
Бумага для измерения pH Hydrion (6,0–8,0)	Лаборатория Micro Essential	345	Бумага для измерения pH в диапазоне 6,0–8,0.
Устройство безопасности для подкожных инъекций Needle-Pro EDGE, 18 г	Смитс Медикал	401815	Иглы 18 G с безопасными колпачками.
Встроенный манометр	МиллипорСигма	20469	Манометр для контроля давления в баллоне.
Инкубационный шейкер Innova 42	Эппендорф	2231000756	Комбинированный инкубатор/орбитальный шейкер.
Шприц Luer-Lok с прикрепленной иглой	Бектон Дикинсон	309580	Комбинация шприца 3 мл и иглы 18 г.
Ассортимент клапанов Люэра	Мировые прецизионные приборы	14011	Клапаны для трубок проточного газа.
Орбитальный шейкер LSE	ThermoFisher Scientific	6780-НП	Орбитальный шейкер для перемешивания среды во время фильтрации.
Гептагидрат сульфата магния	МиллипорСигма	М2773	Твердая английская соль (сульфат магния, гептагидрат).
Одноступенчатый регулятор медицинского воздуха с расходомером	Западные предприятия	М1-346-15ФМ	Регулятор расхода воздуха с расходом 15 л/мин.
Раствор аминокислот MEM (50x)	МиллипорСигма	М5550	Концентрированный раствор незаменимых аминокислот.
Раствор заменимых аминокислот MEM (100x)	МиллипорСигма	М7145	Концентрированный раствор заменимых аминокислот.
Фильтр Millex-GP, 0,22 мкм	МиллипорСигма	SLMP25SS	0,22 мкм полиэфирсульфоновый мембранный стерильный шприцевой фильтр.
Milli-Q Академический	МиллипорСигма	ZMQS60E01	Система фильтрации стерильной воды Milli-Q.
Монитор кислорода MiniOX 3000	МСА	814365	Контроль процентного содержания кислорода в газовом потоке.
Буфер MOPS (1 м, pH 9,0)	Бостон БиоПродукты	ББМ-90	Буфер MOPS для регулировки pH среды.
Муцин из свиного желудка	МиллипорСигма	М2378	Порошок муцина (гликозилированного гелеобразующего белка).
Хлористый калий	МиллипорСигма	П9541	Твердая соль хлористого калия.
Одноразовые мешалки из ПТФЭ	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Одноразовые магнитные мешалки.
Резьба из ПТФЭ Уплотнительная тефлоновая лента	ВВР	470042-938	Тефлоновая лента для армирования соединений газовых систем.
Очистительный картридж Q-Gard 2	МиллипорСигма	QGARD00D2	Очистительный картридж для системы Milli-Q.
Многоразовые бутылки для хранения носителей	ThermoFisher Scientific	06-423А	Бутылки для смешивания и хранения питательных сред.
Резиновая пробка, 30 мм, Бромбутил серый	DWK Медико-биологические науки	224100-331	Резиновые пробки для флаконов с сывороткой.
Флакон с сывороткой и формованными градуировками, 500 мл	DWK Медико-биологические науки	223952	Стеклянные флаконы с сывороткой для герметичного культивирования.
Набор удлинителей малого диаметра	Браун Медикал	471960	Удлинитель трубки с соединителями замка Люэра.
Хлорид натрия	МиллипорСигма	С3014	Твердая соль хлорида натрия.
Смесь следов металлов, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	Концентрированный раствор физиологических микрометаллов.
Алюминиевое уплотнение без футеровки, 30 мм	DWK Медико-биологические науки	224187-01	Алюминиевые уплотнители обжаты поверх резиновых стопоров.