Количественное определение колониеобразующих единиц кишечно-ассоциированных бактерий у мух дрозофил

Аннотация

Источник: Dodge, R., et al. Быстрый подсчет колониеобразующих единиц в формате 96-луночного планшета применен к микробиому дрозофилы . J. Vis. Exp. (2023)

В этом видео демонстрируется количественная оценка колониеобразующих единиц (КОЕ) кишечно-ассоциированных бактерий у мух дрозофилы с использованием метода серийного разведения и осаждения. Гомогенизированные образцы мух, содержащие кишечные бактерии, последовательно разбавляют, наносят на агар и инкубируют для обеспечения роста колонии. Затем изображения пластин анализируются с помощью программного обеспечения для выравнивания, сегментации и подсчета колоний в каждой точке, что обеспечивает точную количественную оценку КОЕ.

Протокол

1. Гомогенизация мух по отдельности в 96-луночном ПЦР-планшете

1. Заранее подготовьте тарелки для взбивания бусин.
   1. Насыпьте стеклянные шарики размером 0,5 мкм (см. Таблицу материалов) на лоток для измерения шариков. Разложите бусины на подносе так, чтобы все лунки были полными и ровными, а затем смахните лишние бусины в коническую трубку, чтобы восстановить их.
   2. Поместите планшет для полимеразной цепной реакции (ПЦР) с полуюбкой (см. Таблицу материалов) вверх ногами на измерительный лоток и совместите его с лунками, вставив его в углубление на лотке. Затем быстро переверните его, чтобы перенести бусины.
   3. Удалите лишние бусины с поверхности ПЦР-планшета и накройте его фольгой. Осмотрите планшет для ПЦР, чтобы убедиться, что все лунки содержат бусины. Используйте мерную ложку, если необходимо добавить шарики в одну лунку. Если статическое электричество приводит к прилипанию шариков к поверхности пластин, протрите или распылите на заднюю часть мерного лотка и ПЦР-пластину 70% этанола.
   4. Накрыть алюминиевой фольгой. Многие тарелки могут быть приготовлены таким образом, а затем автоклавированы и сохранены для последующего использования. Когда все будет готово к использованию, добавьте 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) в каждую лунку с помощью 96-канального дозатора (см. Таблицу материалов).
2. Перед гомогенизацией стерилизуйте мух, колонизированных микробами, с помощью 70% этанола.
   1. Обезболивайте мух 100%_СО2 в течение 5 с. Перенесите обезболенных мух из флакона в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с помощью небольшой воронки (рисунок 1A-2). В этом исследовании обычно добавляли 25 мух на пробирку.
   2. Немедленно распылите ~1 мл 70% этанола в пробирку, закройте пробирку и перемешайте путем инверсии в течение 10 с. Затем аспирируйте этанол с помощью пипетки P1000, стараясь не отсасывать мух. Повторите еще раз с этанолом, затем дважды со стерильным PBS (рисунок 1A-3).
3. После окончательной промывки PBS закройте тюбик и, опустив крышку вниз, несколько раз сильно постучите по скамейке, чтобы мухи попали в колпачок.
4. Откройте трубку и с помощью щипцов раздайте мухи в лунки (рисунок 1А-4). Поместите по одной мухе в каждую лунку (рисунок 1А-5). Держите тарелку на льду во время загрузки, чтобы мухи находились под наркозом.
5. Запечатайте пластину термосвариваемой фольгой Thermal Bond (см. Таблицу материалов).
   1. Во-первых, удалите все случайные шарики, которые находятся близко к лункам, так как они могут вызвать утечку в уплотнении из фольги. Убедитесь, что матовая сторона фольги ориентирована вниз на пластину, а блестящая сторона вверх к термосварщику. Плотно прижмите термосварщик (см. Таблицу материалов) в течение 5 с (Рисунок 1A-6). Отполируйте ручным аппликатором (см. Таблицу материалов), чтобы закрепить фольгу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плохая герметизация является причиной потери пробы.
6. Закрепите тарелку в встряхивателе для тарелок. Гомогенизировать в течение 5 минут (Рисунок 1A-7). Вращайте пластину валика в течение 30 секунд в мини-пластине (см. Таблицу материалов) при 350 x g , чтобы удалить жидкость из уплотнительной пленки.
7. Снимите фольгу, удерживая пластину, чтобы не выплеснуть капли мухоподобного гомогената из лунок.

2. Серийное разведение мухового гомогената и пятнистость на пластинах КОЕ

1. Поместите четыре прямоугольные пластины для выращивания агара де Мана, Рогосы и Шарпа (MRS) (см. Таблицу материалов) в шкаф биобезопасности и снимите их крышки. В этом протоколе для выращивания L. plantarum использовался агар MRS. Оставьте эти тарелки сушиться не менее чем на 10 минут (20 минут, если они свежевылитые или холодные из хранения).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если планшеты влажные, капли с 96-луночного планшета будут стекать вместе и портить подсчет.
2. Приготовьте три разбавляющие планшета, добавив 100 мкл PBS в каждую лунку стерильного 96-луночного планшета с помощью 96-канального пипеттора. Загрузите штатив с наконечниками P20 в 96-канальный пипеттор.
3. Сделайте разведение в соотношении 1:10 путем аспирации 11,1 мкл гомогената из образца планшета, приготовленного в разделе 1 (рис. 1A-8). Обязательно черпайте из середины лунок, а не со дна лунок, потому что гомогенат мухи и стеклянные шарики забьют пипетки. Шарики тонут, а частицы мухи плавают, оставляя средний слой в основном чистым.
4. Дозируйте 11,1 мкл в первую разбавляющую пластину, которая уже содержит 100 мкл стерильного PBS на лунку. Удерживайте пластину разбавления на встряхивателе в течение 10 с частотой 600 оборотов в минуту (об/мин). Перемешайте еще раз, пипетируя вверх и вниз в течение пяти циклов. Перелейте 11,1 мкл с первой разбавляющей пластины на вторую разбавляющую пластину и повторите этапы смешивания для следующих двух разбавляющих пластин.
5. Выполните серийное покрытие разбавления, как описано ниже.
   1. Достаньте пластины роста из шкафа биобезопасности.
   2. Начиная с наиболее разбавленной пластины, нанесите 2 мкл из каждой лунки на агаровые пластины с помощью 96-луночного пипеттора (рис. 1A-9).
      1. Медленно опустите головку пипетки на пластину, стараясь не вонзить ее в агар. Внимательно осмотрите тарелку и убедитесь, что все пятна были удалены; если нет, вручную добавьте 2 мкл в соответствующее положение. Проверьте, чтобы пятна от жидкости быстро впитались в агар и не слипались.
      2. Если пятна срастаются, высушите новый набор свежих агаровых пластин в течение более длительного периода времени и повторите пятнистость. Если существует несколько типов планшетов (например, с разными средами или с антибиотиками), обратите внимание и на них. Снесите оставшийся раствор обратно в разбавляющую пластину и перейдите к следующей более высокой концентрации.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При обнаружении пятнистых разведений смешайте следующее разведение пять раз, чтобы убедиться, что содержимое наконечников пипеток очищено от предыдущего разведения. Разбавляющие планшеты могут храниться в течение >8 ч при температуре 4 °C, не влияя на количество колоний.
6. Повторите процесс нанесения покрытия, как описано в шаге 2.5, для остальных разбавляющих пластин, постепенно переходя от наиболее разбавленных к наиболее концентрированным до тех пор, пока не будет получена пластина с исходным гомогенатом.
7. Когда вся жидкость впитается в агар, переверните пластины и поместите их в инкубатор (рисунок 1А-10). Для Lactiplantibacillus и Acetobacter из семейства Drosophila оптимальная температура составляет 30 °C на средах MRS. Инкубируйте до тех пор, пока колонии не достигнут оптимального размера: колонии достаточно велики, чтобы их можно было четко видеть, но не настолько велики, чтобы они сливались или мешали росту друг друга (см. репрезентативные результаты для количественной оценки оптимального размера).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные условия роста зависят от штамма и должны быть определены опытным путем. Для Lactiplantibacillus от дрозофилы оптимальное время инкубации составляет от 26 до 30 ч на агаре MRS. Для Acetobacter из дрозофилы оптимальное время инкубации составляет от 30 до 48 ч на MRS, в зависимости от штамма.
8. После инкубации при необходимости храните планшеты при температуре 4 °C до тех пор, пока они не будут готовы к подсчету.

3. Количественная оценка колониеобразующих единиц (КОЕ)

1. Количественно оцените КОЕ, сфотографировав пластины, а затем подсчитав колонии с помощью автоматизированного программного обеспечения, как описано ниже. Если пластины хранились при температуре 4 °C, сначала дайте им нагреться до комнатной температуры, чтобы на пластинах не было конденсата, образующего блики.
2. Организуйте пластины в логической последовательности и придерживайтесь их в таком порядке во время фотографирования — так будет проще называть файлы. Сориентируйте все пластины так, чтобы А1 был в верхнем левом углу для всех пластин. Рекомендуется пометить угол формата А1 уникальным идентификатором, чтобы не перепутать фотографии. Сложите каждую серию разведения по порядку.
3. Снимите крышку тарелки и поставьте тарелку на сцену так, чтобы А1 был ориентирован в правильном углу. Фотобокс для тарелок оптимизирован для фотографирования этих тарелок и включает в себя опции освещения и фильтра для изображения флуоресцентных колоний.
4. Представьте себе таблички. Используйте камеру (см. Таблицу материалов) с ручными настройками для достижения постоянного уровня экспозиции между пластинами. Рекомендуется использовать большое фокусное расстояние, чтобы свести к минимуму искажения перспективы. Сделайте снимок с помощью дистанционного затвора, чтобы свести к минимуму размытие из-за дрожания камеры.
5. Перенесите изображения на компьютер и переименуйте их, указав название эксперимента, тип среды, коэффициент разбавления и любые другие соответствующие детали. Некоторые операционные системы (см. Таблицу материалов) имеют полезную функцию пакетного переименования в Finder путем щелчка правой кнопкой мыши по выбранным файлам.

4. Автоматизированный подсчет колоний с помощью пакета Count-On-It

1. Обрежьте изображения с помощью предоставленного плагина Croptacular для ImageJ. Этот плагин помогает разделить изображение на упорядоченный массив подобластей (например, 8 x 12 для 96-луночного планшета). Субрегионы будут подсчитываться по отдельности.
   1. Организуйте изображения, которые будут обработаны для количественной оценки, в папку. Выбирайте имена файлов, которые отличают пластины, так как эти имена файлов становятся заголовками столбцов для каждого набора счетчиков. В этой папке создайте подпапки с именами «обрезанный» и «квитанции».
   2. Запустите Croptacular, и нажмите OK , чтобы начать обрезку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отображаются настройки по умолчанию, которые обычно достаточны. В зависимости от разрешения изображения, освещения, размера пятна и т. д., может быть полезно настроить базовые параметры.
   3. Если изображение уже прямое, просто нажмите Пробел. В противном случае выпрямите изображение, проведя линию вдоль края, который должен стать горизонтальным. Перерисовывайте линию столько раз, сколько необходимо, если изображение по-прежнему не выглядит выпрямленным.
   4. Далее нарисуйте ограничивающий прямоугольник области, для которой будет производиться подсчет. Регулируйте размер и пропорции до тех пор, пока все пятна не окажутся внутри своих ячеек. Перетащите курсор за пределы рамки границы, чтобы обновить сетку. Когда сетка будет выглядеть хорошо, нажмите клавишу Space.
   5. Убедитесь, что следующее изображение автоматически поворачивается на тот же угол, что и первое; Плагин предполагает, что все фотографии выровнены одинаково. Если это верно, нажмите Space , чтобы продолжить. В противном случае выпрямите изображение, как и раньше. Сетка также напоминает то же положение, что и предыдущее изображение; При необходимости отрегулируйте, а затем нажмите клавишу Space.
2. Пронумеруйте колонии на пластинах с помощью предоставленного плагина Count-On-It: Gridiron для ImageJ.
   1. Запустите Count-On-It > Gridiron. Используйте те же настройки сетки, что и в Croptacular. Пользователи могут объединить в пакетную обработку целую папку, проанализировать одно изображение или начать с текущего изображения.
   2. Установите пороговое значение на основе верхнего и нижнего значений интенсивности пикселей. Сделайте порог как можно более строгим, при этом выбрав все колонии. В идеале между выбранными колониями должно быть некоторое пространство, но программное обеспечение способно в определенной степени сегментировать блобы. Нажмите OK в диалоговом окне "Требуется действие", когда пороговое значение будет удовлетворительным.
   3. Чтобы проверить результаты, увеличьте масштаб и более внимательно посмотрите на количество колоний. Нажатие кнопки «Отмена» приведет к прерыванию работы плагина. Нажмите OK , чтобы продолжить.
   4. На первом изображении убедитесь, что у вас есть возможность продолжить или вернуться в меню настройки, например, изменить минимальный размер колонии. Чтобы продолжить пакетный процесс, нажмите OK . Затем выберите папку для хранения чеков и таблицы результатов. Используйте папку "receipts" или создайте новую папку.
   5. После первого изображения следующие изображения по умолчанию будут иметь тот же порог, что и предыдущие настройки. Нажмите OK , чтобы использовать эти настройки или изменить их. Если фотографии согласуются друг с другом и настройки точны, нажмите OK в диалоговом окне «Требуется действие».
      ПРИМЕЧАНИЕ: После того как все изображения в пакете будут завершены, таблица результатов автоматически сохранится в той же папке, что и квитанции.
   6. Просматривайте квитанции подсчета, созданные программным обеспечением, и вручную исправляйте все ошибки подсчета. Плагин ImageJ статистически точен, но ошибки все же случаются. Проверяйте квитанции, чтобы проверить выбросы и выявить ошибки в подсчете. Программное обеспечение сохраняет данные КОЕ в виде файла .csv в той же папке, что и квитанции.
3. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения, предпочитаемого пользователем.

Результаты

Рисунок 1: Колонизационный анализ измеряет КОЕ у сотен отдельных мух с использованием формата 96-луночных планшетов. (A) Иллюстрированный обзор использованного метода колонизационного анализа и высокопроизводительного количест...

Материалы