Количественное определение колониеобразующих единиц кишечно-ассоциированных бактерий у мух дрозофил

Аннотация

Источник: Dodge, R., et al. Быстрый подсчет колониеобразующих единиц в формате 96-луночного планшета применен к микробиому дрозофилы . J. Vis. Exp. (2023)

В этом видео демонстрируется количественная оценка колониеобразующих единиц (КОЕ) кишечно-ассоциированных бактерий у мух дрозофилы с использованием метода серийного разведения и осаждения. Гомогенизированные образцы мух, содержащие кишечные бактерии, последовательно разбавляют, наносят на агар и инкубируют для обеспечения роста колонии. Затем изображения пластин анализируются с помощью программного обеспечения для выравнивания, сегментации и подсчета колоний в каждой точке, что обеспечивает точную количественную оценку КОЕ.

Протокол

1. Гомогенизация мух по отдельности в 96-луночном ПЦР-планшете

1. Заранее подготовьте тарелки для взбивания бусин.
   1. Насыпьте стеклянные шарики размером 0,5 мкм (см. Таблицу материалов) на лоток для измерения шариков. Разложите бусины на подносе так, чтобы все лунки были полными и ровными, а затем смахните лишние бусины в коническую трубку, чтобы восстановить их.
   2. Поместите планшет для полимеразной цепной реакции (ПЦР) с полуюбкой (см. Таблицу материалов) вверх ногами на измерительный лоток и совместите его с лунками, вставив его в углубление на лотке. Затем быстро переверните его, чтобы перенести бусин....

Результаты

Рисунок 1: Колонизационный анализ измеряет КОЕ у сотен отдельных мух с использованием формата 96-луночных планшетов. (A) Иллюстрированный обзор использованного метода колонизационного анализа и высокопроизводительного количест.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Биение борта и точечное покрытие
Флаконы с мухами	Дженеси	32-121	Автоклавируемый
Пробки для флаконов от мух	Дженеси	59-201	Автоклавируемый
Ручной аппликатор	3 МИН.	3М ПА1
Термосварщик	Эппендорф	5390
Мини-бисеробитер 96	БиоСпек	1001
Mini-BeadBeater Бусины стеклодробилки, 0,5 мм	БиоСпек	11079105
MPS 1000 Мини Спиннер для ПЦР планшетов	Лабнет	LI-CF-P1000
Полуавтоматический пипетка Rainin BenchSmart 96	Mettler Toledo	30296705	Доступны менее дорогие варианты, в том числе шлицевой инструмент с 96-луночным штифтом от VP Scientific
TempPlate полуюбок 96-луночный ПЦР-планшет, прямая юбка, натуральный	Научные США	1402-9220	Должен быть полипропиленом для термосварщика
Термосвариваемая фольга	4titude	4ти-0591	Сохраняйте стерильность
Тарелка для лотка,128 x 85 мм, Полистирол, Стерильный	SPL Медико-биологические науки	31001	Для изготовления прямоугольных агаровых плит
Конструирование фотобокса
Болты 1/4"-20 x 1/2" (x2)	Амазонка	ASIN: B07BP1WR3H	Чтобы прикрепить кронштейн камеры. Бренд не важен. Любой болт 1/4"-20 1/2" работает.
Соединительная гайка 1/4"-20 x 1/2"	Амазонка	СКП: 799862376780	Он же колпачковая гайка или соединительный болт. Это необходимо для крепления резинок на держателе пластины. Бренд не важен.
Болты 1/4"-20 x 3/4" (X3)	Амазонка	АСИН: B003QZSZY4	Для держателя тарелки. Бренд не важен.
Шайба 1/8 x 1/2 дюйма	Амазонка	СКП: 611982484599	Шайба для колпачковых гаек на внешней стороне коробки. Бренд не важен. Перед прикреплением распылите черную краску, чтобы растушевать с акрилом.
Провод 18 калибра - двухжильный силовой провод - силовой провод 18 AWG - 10 футов	Superbrightleds.com	РГ18-2
22-10 Гайка для красной проволоки AWG - WN-R2210 - Количество 4	Superbrightleds.com	ВН-Р2210
22-18 AWG 3/16 дюйма Гнездовой нажимной разъем - 22-18 AWG - Количество 3	Superbrightleds.com	СКФП-2218
4-дюймовый разъем для перемычки без пайки - 8 мм одноцветная светодиодная лента для подсветки - количество 3	Superbrightleds.com	СБЛ-МА2П-8-2
4-дюймовый адаптер для косички без пайки - 8 мм одноцветные светодиодные ленты - количество 3	Superbrightleds.com	СБЛ-МА2П-8-1
Ручка ящика 6 дюймов	Амазонка	ASIN: B07Z331P99	Подойдет любая ручка ящика.
Выдвижные ящики 6 дюймов	Btibpse	СКП: 712243424979	Обрежьте резиновые стопоры с мягким закрытием на ползунках ящика.
8-32 x 1/2" Колпачковые гайки (x4)	Амазонка	АСИН: B00HYLZB98	Крепится скользящими болтами ящика на внешней стороне коробки. Бренд не важен. Нейлон не повредит акрил. Перед прикреплением распылите черную краску, чтобы растушевать с акрилом.
8-32 x 1/2" нейлоновые болты (x4)	Амазонка	АСИН: B07KX9T7NF	Для крепления ящика можно использовать направляющие. Бренд не важен. Любой болт или крепежный винт, соответствующий техническим характеристикам, подойдет. Нейлон не повредит акрил и позволяет срезать болт заподлицо с гайкой. Перед прикреплением распылите черную краску, чтобы растушевать с акрилом.
Акриловый клей	SCIGRIP	Эан: 7844908489337	SCIGRIP Weld-On #4 Клей, пинта и приварной аппликатор Бутылка с иглой
Черные кабельные стяжки - 10 шт. в упаковке - 4 дюйма в длину	Superbrightleds.com	КТ-Б04-10
L-образный кронштейн камеры	WLPREOE, Vikerer, Без бренда	АСИН: B09X46YKQZ	Кронштейн должен быть «перевернут» от его предполагаемой конфигурации так, чтобы камера находилась «снаружи» L. Некоторые кронштейны состоят из двух частей и позволяют использовать альтернативную конфигурацию, некоторые - нет, вам понадобится один, который можно перевернуть. Также должен иметь отверстия 1/4 дюйма для крепления. WLPREOE, Vikerer, Небрендированный. В качестве примера приведен серийный идентификационный номер Amazon.
Фотоаппарат Canon серии T для опции модема ИЛИ	Canon, Panasonic, Sony, Nikon и т.д.	1894К002	Камеры серии Canon Ti являются хорошим вариантом и могут быть привязаны к компьютеру. Используйте со стандартным объективом 18–55 мм. Рекомендуется использовать варианты от Canon T5 до T7 (текущая модель).
Одноцветная светодиодная лента нестандартной длины - Лента серии Eco - 24 В - IP20 - 250 лм/фут - Синий - 2 метра	Superbrightleds.com	СТН-BBLU-B6A-08C1M-24V
Одноцветный светодиодный ленточный фонарь нестандартной длины - Ленточный светильник серии Eco - 24 В - IP20 - 250 лм/фут - Зеленый - 2 метра	Superbrightleds.com	СТН-БГРЕ-Б6А-08К1М-24В
Одноцветный светодиодный ленточный фонарь нестандартной длины - Ленточный светильник серии Eco - 24 В - IP20 - 250 лм/фут - Натуральный белый 4000K - 2 метра	Superbrightleds.com	СТН-А40К80-Б6А-08К1М-24В
Сверло со сверлами 1/4", 1/8"	Блэк энд Декер	BDCDD12PK	Бренд не важен.
Плоская черная аэрозольная краска, 2X ультраматовая	Рустолеум	331182	Покрасьте внутреннюю часть всего FLAT в черный цвет. Бренд не важен.
Лазерная резка акриловых стен	Большая синяя пила	www.bigbluesaw.com	Используйте приложенный PDF-файл, удалите все вырезы в верхней части, кроме желаемого отверстия для камеры
Светодиодный импульсный источник питания Mean Well - серия LPV 20-100 Вт светодиодный блок питания с одним выходом - 24 В постоянного тока - 20 Вт	Superbrightleds.com	ЛПВ-20-24
Panasonic ZS100 для подключения к телефону, планшету или компьютеру по Wi-Fi	Canon, Panasonic, Sony, Nikon и т.д.	DMC-ZS100K	Камеры Panasonic могут быть беспроводно подключены к компьютеру для передачи данных и опции дистанционного спуска затвора. Б/у варианты хорошие.
Быстросъемная пластина	Neewer Алюминиевая быстросъемная пластина 50 мм QR Clamp 3/8 дюйма с 1/4 дюйма	АСИН: B07417F21D	Добавьте его в кронштейн, чтобы камеру можно было легко снять для смены цветных фильтров. В качестве примера приведен серийный идентификационный номер Amazon.
Резинки, Разные размеры	Продукция BAZIC	Альянс Каучук 26649	Резинки идут на держатель пластины. Бренд не важен.
Основания для крепления винтовой / клейкой кабельной стяжки - 3/4 дюймовая база - Количество 4	Superbrightleds.com	СТМБ-20
Круглый кулисный переключатель SPST - без светодиода - количество 3	Superbrightleds.com	РРС-СП
Фильтр Tiffen 29 (красный) 72 мм	Тиффен	72R29
Фильтр Tiffen 58 (зеленый) 72 мм	Тиффен	7258
Программное обеспечение
ИзображениеJ64	https://imagej.net/downloads	Н/Д	Свободный. Просто процитируйте: Шинделин, Д., Арганда-Каррерас, И., Фризе, Э., Кайниг, В., Лонгэйр, М., Питч, Т., ... Кардона, А. (2012). Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений. Методы природы, 9 (7), 676–682. DOI:10.1038/nmeth.2019
MacOSX	Яблоко	Н/Д	Имеет полезную функцию пакетного переименования в Finder для переименования группы фотографий для упрощения организации и анализа в Count-on-it.
Юникс	BSD	Н/Д	64 бит
Виндоус	Майкрософт	Н/Д	64 бит