Обработка бактерий экссудатами корней растений для имитации in vitro взаимодействия растений и микробов

Аннотация

Источник: Yi, Y., et al. Взаимодействие растений и микробов: транскрипционная реакция Bacillus mycoides на экссудаты корней картофеля. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется приготовление и обработка культур Bacillus mycoides для изучения взаимодействия растений и микробов. В нем описаны этапы от нарезки скотоводческой культуры и ее инкубации в жидкой среде до воздействия на бактерии корневых выделений растений при перемешивании. Процесс завершается сбором и мгновенной заморозкой бактериальных клеток для последующего анализа изменений экспрессии генов, вызванных экссудатом.

Протокол

1. Выращивание бактерий

1. Нанесите штамм B. mycoides из глицеринового запаса -80 °C на агаровую пластину Luria-Bertani (LB) и инкубируйте пластину при 30 °C в течение ночи.

2. Инокулируйте жидкую среду LB с одной колонией из планшета и выращивайте культуру в встряхивающем инкубаторе при 200 об/мин в течение ночи при
30 °С.

2. Обработка и отбор проб бактерий

1. Чтобы сравнить кривую роста бактерий, обработанных корневыми выделениями, с отрицательным контролем, приготовьте серию колб, содержащих 50 мл жидкой среды LB. Добавьте 0,5 мл ночной бактериальной культуры во все колбы и добавьте в среду либо 0%, 5%, 10% или 15% (v/v) экссудата корня или стерильную деионизированную воду соответственно.

2. Используйте культуру с деионизированной водой вместо корневых выделений в качестве контроля. Измеряйте оптическую плотность на длине волны 600 нм (наружный диаметр₆₀₀) каждые 1 час после этого. Постройте кривую роста, построив график зависимости значений наружного диаметра₆₀₀ от времени.

3. Разведите культуру B. mycoides на ночь с 90 мл предварительно подогретой LB среды до начального наружного диаметра₆₀₀ ~ 0,05 в колбе объемом 300 мл. Добавьте в культуру 10 мл корневых выделений и инкубируйте при 30 °C в течение 1 ч.

4. Используйте 10 мл стерильной деионизированной воды в качестве контроля. Соберите клетки из культуры путем центрифугирования при 9 000 x g в течение 2 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и немедленно заморозьте гранулу в жидком азоте, затем храните при -80 °C до использования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Гипохлорит натрия	Сигма	CAS: 7681-52-9	10-15% активного хлора
Бульон Лурия-Бертани (LB)
Инкубатор	Научный центр Нью-Брансуика	Иннова 4000
Спектрофотометр	Thermo Fisher Scientific	Генезис 20
Жидкий азот
Стеклянные бусины	Сигма	Г8893	0,5 мкм
Туба 2,0 мл с завинчивающейся крышкой			Без РНКазы
Пробирка Eppendorf 1,5 мл и 2,0 мл			Без РНКазы
Центрифуга	Эппендорф	5430