Анализ роста бактерий с ограниченным содержанием металлов для изучения роли генов, чувствительных к металлу

Аннотация

Источник: Maurakis, S., et al. Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae для характеристики металлочувствительных генов и приобретения металлов из лигандов хозяина. J. Vis. Exp. (2020).

В этом видео демонстрируется анализ роста бактерий с ограничением металлов для изучения роли генов, чувствительных к металлу. Бактерии дикого типа и мутантные бактерии, выращенные в среде с обедненным металлами, инкубируют с металл-лигандом, а их рост контролируют с помощью планшетного ридера. В условиях обеднения металлами бактерии дикого типа экспрессируют поверхностный рецептор, который обеспечивает поглощение и рост металлов, в то время как у мутанта отсутствует этот рецептор, что приводит к ограничению роста.

Протокол

1. Приготовление стоковых растворов с обработанной Chelex определенной средой (CDM)

1. Стоковый раствор I
   1. Смешайте хлорид натрия или NaCl (233,8 г), сульфат калия или K₂SO₄ (40,0 г), хлорид аммония или NH₄Cl (8,8 г), дикалий гидрофосфат или K₂HPO₄ (13,9 г) и монокалия дигидрофосфат или KH₂PO₄ (10,9 г) в деионизированной воде до конечного объема 1 л.
   2. Процедить-стерилизовать раствор и разложить по коническим пробиркам объемом 50 мл.
   3. Хранить при температуре -20 °C.
2. Стоковое решение II
   1. Соедините тиамин соляную кислоту или HCl (0,2 г), тиамина пирофосфат-Cl (0,05 г), пантотенат кальция (0,19 г) и биотин (0,3 г) в 50% (об/об.) этаноле до конечного объема 1 л.
   2. Аликвот в конические пробирки объемом 50 мл и хранить при температуре -20 °C.
3. Стоковое решение III
   1. Соедините L-аспартат (4,0 г), L-глутамат (10,4 г), L-аргинин (1,2 г), глицин (0,2 г), L-серин (0,4 г), L-лейцин (0,72 г), L-изолейцин (0,24 г), L-валин (0,48 г), L-тирозин (0,56 г), L-пролин (0,4 г), L-триптофан (0,64 г), L-треонин (0,4 г), L-фенилаланин (0,2 г), L-аспарагин-Н₂О (0,2 г), L-глютамин (0,4 г), L-гистидин-HCl (0,2 г), L-метионин (0,12 г), L-аланин (0,8 г), L-лизин (0,4 г) и восстановленный глутатион (0,36 г) в 500 мл деионизированной воды.
   2. L-цистеин (0,44 г) и L-цистин (0,28 г) растворить в минимальном объеме (~1 мл) 1 М HCl и добавить в вышеуказанный раствор аминокислоты.
   3. Отрегулируйте pH раствора с помощью 10 Н гидроксида натрия (NaOH) до тех пор, пока все твердые частицы не растворятся. Итоговый pH будет 10,0–11,0.
   4. Доведите окончательный объем до 1 л с помощью деионизированной воды.
   5. Процедить-простерилизовать раствор и аликвот в объеме 250 мл.
   6. Хранить при температуре -20 °C.
4. Стоковый раствор IV
   1. Растворите глюкозу (200 г) в деионизированной воде до конечного объема 1 л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор может потребоваться нагреть, чтобы растворить глюкозу.
   2. Процедить-простерилизовать и разлить раствор в конические пробирки объемом 50 мл.
   3. Хранить при температуре -20 °C.
5. Стоковое решение V
   1. Смешайте гипоксантин (5,0 г), урацил (5,0 г) и NaOH (4,0 г) в деионизированной воде до конечного объема 1 л.
   2. Фильтр стерилизуют и аликвотируют в конические пробирки объемом 50 мл.
   3. Хранить при температуре -20 °C.
6. Решение VI
   1. Приготовьте 1 М раствор дигидрата хлорида кальция или CaCl_{2-2H 2}O (147 г/л) в деионизированной воде. Фильтр простерилизовать и хранить при комнатной температуре (RT).
7. Стоковое решение VII
   1. Приготовьте 1 М безводный раствор сульфата магния (MgSO₄) в деионизированной воде. Фильтр простерилизовать и хранить при RT.
8. Исходный раствор VIII
   1. Приготовьте 1 М раствор бикарбоната натрия (NaHCO₃) в деионизированной воде. Фильтр простерилизовать и хранить при RT.

2. Приготовление 4x стерильного концентрата и 1x CDM

ПРИМЕЧАНИЕ: Эту процедуру следует выполнять либо в стерильной стеклянной посуде, обработанной кислотой, либо в пластике для предотвращения выщелачивания металлов в растворы.

1. Соедините исходные растворы I (50 мл), II (20 мл), III (250 мл), IV (50 мл) и V (20 мл) с 20,0 г 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты (HEPES) и перемешайте для смешивания.
2. Отрегулируйте pH до 7,4, затем доведите конечный объем до 500 мл с помощью деионизированной воды.
3. Смолу Chelex-100 промыть в 1 л деионизированной воды для удаления консервантов перед добавлением в 4-кратный стерильный концентрат. Для этого добавьте 50 г смолы в 1 л деионизированной воды и помешивайте не менее 1 часа. Удалите воду с помощью вакуумной фильтрации и используйте эту промытую смолу для шага 2.4.
4. Добавьте 50 г смолы и медленно помешивайте ровно 90 минут.
5. Удалите смолу с помощью стерилизации фильтром и храните 4x стерильный концентрат при температуре 4 °C.
6. Чтобы получить рабочую концентрацию CDM 1x, сначала разбавьте концентрат 4x стерильной деионизированной водой, затем добавьте раствор VI (125 мкл на 500 мл 1x раствора), раствор VII (535 мкл на 500 мл) и раствор VIII (10 мл на 500 мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что все исходные растворы уже стерилизованы, рекомендуется снова простерилизовать 1x раствор после приготовления.

3. Подготовка пластин CDM

ПРИМЕЧАНИЕ: По приведенному ниже рецепту получается 1 л среды для тарелок, но лучше всего готовить их в меньших объемах. Все пропорционально уменьшается.

1. Промытый агароз
   1. Растворите 50 г агарозы в 1 л деионизированной воды, помешивая в течение 1 ч.
   2. Перелейте раствор во флакон центрифуги и центрифугуйте при давлении 1 200 x g в течение 15 минут при RT. Осторожно слейте надосадочную жидкость и выбросьте.
   3. Добавьте достаточное количество деионизированной воды, чтобы повторно суспендировать агарозную гранулу, затем переложите в колбу объемом 1 л. Доведите до конечного объема 1 л с деионизированной водой, а затем перемешайте и центрифугируйте, как показано на шаге 3.1.2. Выбросьте надосадочную жидкость.
   4. Добавьте достаточное количество 100% этанола для ресуспендирования гранулы, затем переложите в новую колбу объемом 1 л. Доведите до конечного объема 1 л с этанолом. Перемешайте и центрифугируйте так, как показано на шаге 3.1.2.
   5. Повторите шаг 3.1.4.
   6. Добавьте метанол в агарозную гранулу для восстановления, затем переложите в колбу объемом 1 л. Доведите до конечного объема 1 л с метанолом. Перемешайте и центрифугируйте так, как показано на шаге 3.1.2.
   7. Повторите шаг 3.1.6.
   8. Переложите вымытую агарозу в лоток, застеленный алюминиевой фольгой, и дайте высохнуть в вытяжном шкафу. Когда высохнет, переложите в безметалловую тару для длительного хранения.
2. Добавьте 10 г промытой агарозы и 5 г картофельного крахмала в 750 мл деионизированной воды.
3. Автоклав в течение 30 мин при температуре 121 °C, на 100 кПа выше атмосферного давления.
4. Дайте среде остыть до ~65 °C, затем добавьте 250 мл 4X CDM, 250 мкл раствора VI, 1,07 мл раствора VII и 20 мл раствора VIII.
5. При желании добавьте выбранные металлы перед заливкой тарелок. Добавление хелаторов не является необходимым для поддержания безметалловых условий.
6. Разлить в чашки Петри и дать застыть.

4. Ограниченный металлами рост Neisseria gonorrhoeae

ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев нет необходимости подвергать бактерии металлическому стрессу перед инокуляцией CDM. Начальная стадия удвоения CDM и последующее разбавление достаточны для истощения гонококков их внутренних запасов железа и цинка. Таким образом, первые два этапа следующей процедуры проводят с использованием агаровых пластин, изготовленных из среднего основания гонококка (GC), которые были дополнены добавкой Kellogg's Supplement I и 12,5 мкМ нитратом железа (Fe(NO₃)₃). Если требуется раннее напряжение металла, мы рекомендуем готовить опорные пластины со средним содержанием GC без Fe(NO₃)₃ и с 5 μM TPEN (N,N,N'-тетракисом (2-пиридилметил)этилендиамином) для хелатирования цинка или 10 μМ дефероксамина для хелатирования железа. Вся инкубация проводится при температуре 37 °C с 5%_CO2.

1. За два дня до эксперимента, на -2 день, высадите гонококки из морозильных камер на средние тарелки GC и инкубируйте не более 24 часов.
2. В день -1 высадите одиночные колонии на свежие средние пластины GC. Постарайтесь сделать это за 14–16 ч до эксперимента по выращиванию.
3. В день эксперимента добавьте 5–10 мл 1x CDM в промытую кислотой колбу с перегородкой для оружия объемом 125 мл и используйте это для заглушения колориметра Клетта.
4. Используйте стерильный тампон с ватным наконечником для инокуляции CDM из здоровых одиночных колоний. Стремитесь к 20 единицам Клетта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если колориметр Клетта недоступен, также подойдет спектрофотометр. Универсальной формулы преобразования единиц измерения Клетта в OD не существует, но доступно приблизительное руководство (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
5. Инкубировать с встряхиванием при 250 об/мин примерно до одного удвоения массы (40 единиц Клетта). Это должно занять от 1 до 2 часов.
6. На этом этапе культуры снова разбавляются добавлением достаточного объема CDM, чтобы достичь половины первоначальной плотности культуры (например, если 5 мл культуры увеличились с 20 до 40 единиц Клетта, 15 мл CDM вернут его обратно к 10 единицам Клетта), и рост продолжится, как на шаге 4.5. Конкретное количество обратного разбавления, обработки металлов и т. д. зависит от последующих применений. Ниже мы приведем три примера

5. Анализы роста с ограничением металлов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти анализы описывают готовые премиксы для роста. Приготовление этих смесей описано в разделе 6.

1. Во время удвоения массы на шаге 4.5 проводят предварительную обработку лунок 96-луночного микропланшета 10-кратными премиксами. Кроме того, обозначьте три лунки, которые будут служить заготовками. В эти лунки добавьте 10 μL 10x Premix и 90 μL CDM.
2. После того как количество культур в колбах с боковым оружием удвоится, добавьте по 100 мкл каждой культуры в неиспользуемую лунку в микропланшете и измерьте оптическую плотность на длине волны 600 нм (OD600). Это можно сделать с помощью кювет в спектрофотометре, но при большом количестве деформаций в анализе это может стать громоздким и, как правило, не рекомендуется, если ваш спектрофотометр не может измерять непосредственно с плеча колбы бокового рычага.
   1. Измеряя OD, поместите колбы обратно в инкубатор, чтобы убедиться, что гонококки остаются жизнеспособными.
3. Рассчитайте правильное количество разведения, необходимое для доведения культур до OD600 = 0,02. 10-кратные премиксы оказывают незначительное влияние на наружный диаметр и могут быть исключены из расчета.
4. Разбавьте культуры с CDM в небольших пробирках для культур и добавьте достаточный объем, чтобы разбавить 10x премиксов до 1x в тарелке. Если имеется подогреватель пластин, держите пластину при температуре 37 °C во время работы.
5. Инкубируйте планшет в течение 8–12 ч с встряхиванием в считывателе планшетов, проводя измерения OD600 с нужными интервалами.

6. Металлическая загрузка трансферрина, S100A7 и кальпротектина, а также приготовление 10x премиксов

ПРИМЕЧАНИЕ: Как и при приготовлении CDM, для приготовления раствора используйте стекло или пластик, промытый кислотой.

1. Растворите человеческий трансферрин в концентрации 10 мг/мл (125 мкМ) в исходном буфере (100 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 20 мМ NaHCO₃, рН = 8,4). S100A7 и кальпротектин суспендированы в буфере, состоящем из 20 мМ Tris, 100 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мМ хлорида кальция или CaCl₂, рН = 8,0).
   1. Добавьте раствор феррирования (100 мМ цитрата натрия, 100 мМ NaHCO₃, 5 мМ гексагидрата хлорида железа или FeCl 3-6H₂O, pH = 8,4) в раствор трансферрина для достижения 30% насыщения железом (например, 75 мкл раствора феррирования подходит для 5 мл трансферрина при производстве при концентрации 10 мг/мл).
   2. Добавьте сульфат цинка (ZnSO₄) к S100A7 или кальпротектин в молярном соотношении 50% к белку для создания 25% насыщения (каждая молекула белка имеет два участка связывания металлов). Можно использовать препараты 100 мкМ S100A7 или кальпротектин с 50 мкМ ZnSO₄ .
   3. В обоих случаях необходимо провести перемешивание в течение не менее 1 часа для загрузки металла.
2. Приготовьте 4 л диализного буфера (40 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 20 мМ NaHCO₃, pH = 7,4). Разделите его на два отдельных объема объемом 2 л и поместите один при температуре 4 °C.
3. Добавьте металлизированные белки в диализную кассету с помощью шприца и проводите диализ против первого буферного объема в течение 4 ч в режиме ЛТ.
4. Переместите кассету на второй буферный объем и диализируйте в течение ночи при температуре 4 °C. После этих действий все несвязанные металлы должны быть удалены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем проводить анализ на бицинхониновую кислоту для определения концентрации белка после диализа.
5. Используйте 10-кратный премикс трансферрина для использования трансферрина в качестве единственного источника железа.
   1. Приготовьте эту предварительную смесь путем разбавления 30% человеческого Fe-трансферрина и апотрансферрина крупного рогатого скота (полученного при 125 мкМ, как описано для человеческого трансферрина, без стадии загрузки железом) до 75 мкМ и 30 мкМ, соответственно, в фосфатно-солевом буфере (PBS). Премикс с положительным контролем заменяет 30% Fe-трансферрина на 75 мкМ Fe(NO)₃, а премикс с отрицательным контролем не содержит добавленного железа, оставляя только апотрансферрин крупного рогатого скота. В ростовом анализе разбавляют 10 мкл этих концентратов 90 мкл культуры. Конечные концентрации составляют 7,5 мкМ, 30% человеческого Fe-трансферрина и 3 мкМ апотрансферрина крупного рогатого скота.
6. Используйте модифицированную версию премикса transferrin 10x для S100A7 или использование кальпротектина в качестве единственного источника цинка.
   1. Для получения премикса с положительным контролем добавьте 50 мкМ ZnSO₄ в премикс для трансферрина. Для отрицательного контроля добавьте 50 μМ TPEN и исключите цинк. Затем возьмите по 10 мкл каждого из этих образцов для каждой необходимой лунки и переместите этот объем в новую пробирку. Добавьте к этому вдвое меньший объем стерильного PBS. Например, если 10 лунок будут получать положительный контрольный премикс, возьмите 100 мкл премикса, переместите его в новую пробирку и добавьте 50 мкл PBS. Проделайте то же самое для отрицательного контроля.
   2. Чтобы приготовить премикс S100A7 или кальпротектин, возьмите 10 μл отрицательного контрольного премикса на каждую необходимую лунку, переместите в новую пробирку и добавьте половину этого объема 25% Zn-S100A7 или кальпротектина. В ростовом анализе используйте 15 μL предварительной смеси и разбавьте 85 μL культуры. Конечные концентрации трансферринов остаются такими же, как и на этапе 8.5, с добавлением 5 мкМ Zn, TPEN или S100A7/кальпротектина.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фляги для пистолета 125 мл	Беллко	2578-С0030	Должен быть заказан по индивидуальному заказу
2-Меркаптоэтанол	ВВР	М131	Открыть в вытяжном шкафу
Бумага 3 мм	GE Здоровье	3030-6461	В тексте называется "фильтровальная бумага"
Агароза	Биолон	БИО-41025	Порошок
Нашатырь	Сигма-Олдрич	А9434	Порошок
Бычий трансферрин	Сигма-Олдрич	Т1428	Порошок
Дигидрат хлорида кальция	Сигма-Олдрич	С5080	Порошок
Пантотенат кальция	Сигма-Олдрич	С8731	Порошок
Кальпротектин	Н/Д	Н/Д	Мы предоставляем это через партнера
Смола Chelex-100	Био-Рад	142-2832	Перед использованием промойте деионизированной водой
Стерильный тампон с ватным наконечником	Пуританин	25-806	Хлопок лучше полиэстера подходит для этого применения
Дефероксамин	Сигма-Олдрич	Д9533	Порошок
D-глюкоза	Сигма-Олдрич	Г8270	Порошок
Диализная кассета	Термо	66380	Замочите в буфере перед использованием
Этанол	Коптек	В1016	Легковоспламеняющаяся жидкость, хранить в шкафу для легковоспламеняющихся веществ
Хлорное железо	Сигма-Олдрич	Ф7134	Раздражитель, не вдыхать
Нонагидрат нитрата железа	Сигма-Олдрич	Ф1143	Раздражитель, не вдыхать
GC средняя база	Дифко	228950	Порошок, уже содержит агар
Глицин	Сигма-Олдрич	Г8898	Порошок
ХЕПЕС	Рыбак	Л-15694	Порошок
Человеческий трансферрин	Сигма-Олдрич	Т2030	Порошок
Гипоксантин	Сигма-Олдрич	Н9377	Порошок
Колориметр Клетта	Маностат	37012-0000	Использует цветовую передачу для оценки плотности культуры
L-аланин	Сигма-Олдрич	А7627	Порошок
L-аргинин	Сигма-Олдрич	А5006	Порошок
L-аспарагина моногидрат	Сигма-Олдрич	А8381	Порошок
L-аспартат	Сигма-Олдрич	А9256	Порошок
L-цистеина гидрохлорид	Сигма-Олдрич	С1276 г.	Порошок
L-цистин	Сигма-Олдрич	С8755	Порошок
L-глутамат	Сигма-Олдрич	Г1251	Порошок
L-глютамин	Сигма-Олдрич	Г3126	Порошок
L-гистидинмоногидрохлорид	Сигма-Олдрич	Н8125	Порошок
L-изолейцин	Сигма-Олдрич	И2752	Порошок
L-лейцин	Сигма-Олдрич	Л8000	Порошок
L-лизин	Сигма-Олдрич	Л5501	Порошок
L-метионин	Сигма-Олдрич	М9625	Порошок
L-фенилаланин	Сигма-Олдрич	П2126	Порошок
L-пролин	Сигма-Олдрич	П0380	Порошок
L-серин	Сигма-Олдрич	С4500	Порошок
L-треонин	Сигма-Олдрич	Т8625	Порошок
L-триптофан	Сигма-Олдрич	Т0254	Порошок
L-тирозин	Сигма-Олдрич	Т3754	Порошок
L-валин	Сигма-Олдрич	В0500	Порошок
Сульфат магния	Сигма-Олдрич	М7506	Порошок
Метанол	ВВР	BDH1135-4LP	Легковоспламеняющаяся жидкость, хранить в шкафу для легковоспламеняющихся веществ
Калийфосфат двухосновной	Сигма-Олдрич	60356	Порошок
Калийфосфат одноосновной	Сигма-Олдрич	П9791	Порошок
Сульфат калия	Сигма-Олдрич	П0772	Порошок
Картофельный крахмал	Сигма-Олдрич	С4251	Порошок
Восстановленный глутатион	Сигма-Олдрич	Г4251	Обращайтесь осторожно. Может легко окисляться.
С100А7	Н/Д	Н/Д	Мы предоставляем это через партнера
Бикарбонат натрия	Сигма-Олдрич	С5761	Порошок
Хлорид натрия	ВВР	470302	Порошок
Цитрат натрия	Рыбак	С279	Порошок
Гидроксид натрия	Акрос Органик	383040010	Высокая гигроскопичность
Тиамина гидрохлорид	Сигма-Олдрич	Т4625	Порошок
Тиаминпирофосфат	Сигма-Олдрич	С8754	Также называется кокарбоксилазой
ТПЭН	Сигма-Олдрич	П4413	Порошок
Трис	ВВР	497	Порошок
Урацил	Сигма-Олдрич	У0750	Порошок
Гептагидрат сульфата цинка	Сигма-Олдрич	204986	Раздражитель, не вдыхать