Обнаружение поверхностных транспортеров металла у Neisseria gonorrhoeae с помощью точечной блоттинга

Аннотация

Источник: Мауракис, С., и Корнелиссен, К. Н. Ограниченный металлами рост Neisseria gonorrhoeae для характеристики генов, чувствительных к металлу, и приобретения металлов из лигандов хозяина. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео показана процедура обнаружения поверхностных транспортеров металлов у Neisseria gonorrhoeae , выращенных в условиях ограниченного содержания металлов, с использованием метода дот-блоттинга, включающего связывание лигандов, обнаружение антител и колориметрическую визуализацию.

Протокол

1. Обнаружение связывания лиганда с помощью транспортеров металла с наружной мембраной

1. Назад разбавьте культуры тремя объемами CDM (обработанная хелексом определенная среда).
2. Затем выдерживать с встряхиванием в течение 4 ч.
3. Незадолго до отметки 4 ч вырежьте три листа фильтровальной бумаги и кусочек нитроцеллюлозы до приблизительного размера, необходимого для установки в аппарат для блот-блоттинга. Предварительно замочите нитроцеллюлозу в деионизированной воде, затем соберите аппарат с фильтровальной бумагой ниже нитроцеллюлозы.
4. Через 4 ч зарегистрируйте плотность ячеек и стандартизируйте до соответствующей конечной плотности.
5. Пипетируйте клеточные культуры на нитроцеллюлозе и дайте достаточно времени, чтобы фильтровальная бумага впитала всю жидкость.
6. Разберите аппарат, дайте промокателю высохнуть и заблокируйте нитроцеллюлозную мембрану на 1 ч в 5% бычьем сывороточном альбумине или обезжиренном молоке (w/v) в трис-буферном физрастворе.
7. Соберите аппарат для блот-блоттинга, заменив фильтровальную бумагу на парафиновую пленку, чтобы создать герметичное уплотнение под нитроцеллюлозой.
8. Развести представляющий интерес металлсвязывающий лиганд до 0,2 мкМ в блокаторных и зондирующих клетках на 1 ч.
9. Откачайте жидкость с помощью вакуума, промойте кляксу, затем следуйте стандартным иммунологическим процедурам для выработки сигнала. Этапы промывки могут выполняться как в аппарате, так и вне его.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фляги для пистолета 125 мл	Беллко	2578-С0030	Должен быть заказан по индивидуальному заказу
2-Меркаптоэтанол	ВВР	М131	Открыть в вытяжном шкафу
Бумага 3 мм	GE Здоровье	3030-6461	В тексте называется "фильтровальная бумага"
Блокиратор промокательной марки	Био-Рад	170-6404	Обезжиренное сухое молоко
Бычий сывороточный альбумин	Рош	3116964001	Порошок
Кальпротектин	Н/Д	Н/Д	Мы предоставляем это через партнера
Смола Chelex-100	Био-Рад	142-2832	Перед использованием промойте деионизированной водой
Стерильный тампон с ватным наконечником	Пуританин	25-806	Хлопок лучше полиэстера подходит для этого применения
Аппарат для точечной блоттинга	Schleicher & Schwell	10484138	Перед загрузкой образца закройте крышку как можно плотнее
Этанол	Коптек	В1016	Легковоспламеняющаяся жидкость, хранить в шкафу для легковоспламеняющихся веществ
Колориметр Клетта	Маностат	37012-0000	Использует цветовую передачу для оценки плотности культуры
Метанол	ВВР	BDH1135-4LP	Легковоспламеняющаяся жидкость, хранить в шкафу для легковоспламеняющихся веществ
Нитроцеллюлоза	GE Здоровье	10600002	Хранить в защитной оболочке до использования
С100А7	Н/Д	Н/Д	Мы предоставляем это через партнера
Хлорид натрия	ВВР	470302	Порошок
Трис	ВВР	497	Порошок