Культивирование нетипируемых Haemophilus influenzae

Аннотация

Источник: Венупрасад, К. и др., Внутритрахеальное введение Haemophilus influenzae на мышиных моделях для изучения воспаления дыхательных путей. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео показано культивирование нетипируемого Haemophilus influenzae и приготовление стандартизированного по дозе инокулюма для последующих колонизационных или инфекционных исследований.

Протокол

1. Культивирование нетипируемого Haemophilus influenzae (NTHi) и подготовка посевного материала

1. Положите тарелку NTHi на тарелку с шоколадным агаром и держите тарелку вверх дном в увлажнённом инкубаторе с_СО2 на ночь при температуре 37 °С и 5%_СО2. На следующий день культивируйте бактерии в мозговом инфузионном бульоне. Затем добавьте 1 мл бульона в стерильную пробирку объемом 1,5 мл.
2. Центрифугируйте при давлении 4 000 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл стерильного 1x фосфатно-солевого буфера (PBS). Повторите этот шаг один раз.
3. Перенесите 100 мкл ресуспендированного раствора в 900 мкл 1x PBS и измерьте поглощение разбавленной культуры на длине волны 600 нм в спектрофотометре.
4. Определите жизнеспособность и колониеобразующие единицы (КОЕ) инокулюма путем культивирования серийных разведений 1:10 на шоколадных агаровых пластинах и инкубации в течение ночи при 37 °C и 5%_CO2.
5. Основываясь на жизнеспособности и КОЕ, определенных на предыдущем этапе, отрегулируйте инокулятив до конечной концентрации 20 x 10⁶ КОЕ/мл.

Материалы