Измерение частоты неправильной трансляции Mycobacterium smegmatis с помощью репортерной системы GFP/Luciferase

Аннотация

Источник: Chen, Y., et al., Измерение скорости специфической неправильной трансляции микобактерий с помощью репортерных систем с усилением функции. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется метод количественной оценки неправильной трансляции у Mycobacterium smegmatis с использованием индуцируемой GFP и репортерной системы секретируемой мутантной люциферазы. Он показывает, как измеряется люминесценция, возникающая в результате неправильной трансляции, и сравнивается с флуоресценцией GFP для оценки влияния тестовой молекулы на точность трансляции.

Протокол

1. Нанолуклюцифераза (Nluc)/Зеленый флуоресцентный белок (GFP) Репортер

ЗАМЕТКА: Визуальное представление этого метода приведено на рисунке 1.

1. Инокулируйте бактериальный репортерный штамм из исходного материала -80 °C 2 мл среды 7H9. Встряхивайте при температуре 37 °C в течение 1-2 дней, пока наружный диаметр₆₀₀ не достигнет стационарной фазы (наружный диаметр >3).
2. Субкультура до 50 мл среды 7Н9 и выращивание до ОД₆₀₀ достигает поздней стационарной фазы (>4).
3. Перед тем, как поместить бактерии в 96-луночный планшет, добавьте ангидротетрациклин (АТХ) в конечной концентрации 50 нг/мл и хорошо перемешайте. Индукция сыпучей культуры гарантирует, что все лунки содержат одинаковое количество индуктора и что индукция репортера синхронизирована. Поместите бактерии в прозрачную 96-луночную чашку с круглым дном, объемом которой составляет 100 мкл в каждой лунке.
4. Чтобы выявить малые молекулы, влияющие на скорость неправильной трансляции, добавьте соединение в указанной концентрации в выбранные лунки. Для целей настоящего протокола используйте казугамицин (в дозах, указанных на рисунке 2) в качестве иллюстрации. Добавляйте разные дозы касугамицина в выбранные лунки (каждая опытная группа должна содержать не менее двух биологических репликатов).
5. Встряхните и наведите образцы при температуре 37 °C в течение 16-20 часов.
   ЗАМЕТКА: Необходимо заклеить плиту пленкой. Кроме того, все краевые лунки должны быть заполнены не менее чем 200 μл стерильной воды, чтобы ограничить испарение из тестовых лунок.
6. Возьмите по 80 мкл из каждой лунки с помощью многоканальной пипетки и перенесите образцы на черную 96-луночную пластину (что обеспечивает максимальное измерение флуоресцентного сигнала). Измерьте сигнал GFP с помощью люминометра со временем интегрирования 20 мс.
7. После измерения сигнала GFP центрифугируйте планшет при давлении 3 220 x g в течение 10 минут. Перенесите 50 μL надосадочной жидкости на 96-луночный планшет с белым дном (который максимизирует измерение сигнала люминесценции), добавьте 50 μL подложки Nluc в каждую лунку, хорошо перемешайте их и измерьте люминесценцию с помощью люминометра с временем интегрирования 1000 мс.
8. Определите отношение Nluc/GFP путем деления скорректированных значений люминесценции Nluc на флуоресценцию GFP: эта мера (в условных единицах) является относительной мерой аспартата для неправильной трансляции аспарагина.

Результаты

Рисунок 1: Схема измерения коэффициента неправильного перевода репортером Nluc-GFP. Свежая культура M. smegmatis, трансформированная с помощью репортеров Nluc и GFP, выращивается до объема, достаточного для тестирования всех планшетов (п...

Материалы