Синхронизация культур цианобактерий и уплотнение ДНК на основе циклов «свет-темнота»

Аннотация

Источник: Мурата, К. и др., Визуализация уплотнения ДНК у цианобактерий с помощью высоковольтной криоэлектронной томографии. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется синхронное культивирование цианобактерий в циклах «свет-темнота» для изучения циркадного уплотнения ДНК. Флуоресцентная микроскопия выявляет конденсированную ДНК в определенные моменты времени, подтверждая выравнивание клеточного цикла в популяции.

Протокол

1. Синхронное культивирование цианобактерий

1. Культура Synechococcus elongatus PCC 7942 на стерилизованной сине-зеленой среде 11 (BG 11) тарелке (в стерильной пластиковой чашке Петри 9 см), содержащей 1,5% (w/v) агара и 0,3% (w/v) тиосульфата натрия.
2. Поместите планшеты в камеру роста при температуре 23 °C с интенсивностью света 50 μE/^м2/с и подвергните их 12-часовому световому/12-часовому темновому циклу.
3. Раз в неделю перекладывайте клетки на свежие агаровые пластины BG11.
   ЗАМЕТКА: Культуры на агаре будут выглядеть как зеленые полосы активно размножающихся клеток через неделю в этих условиях культивирования.
4. Возьмите зеленые пучки клеток с помощью стерилизованной пламенем проволочной петли и нанесите их на свежую агаровую пластину BG11. Делайте это на чистой скамейке.

2. Мониторинг с помощью флуоресцентной микроскопии

1. Используйте клетки, культивируемые на агаровой пластине, в течение 6 дней для наблюдения за уплотнением ДНК. Соберите клетки с пластины в конце светового периода, вылив на клетки 1 мл 0,2 М раствора сахарозы. Повторите выливание раствора на клетки, чтобы собралась большая часть клеток. Перенесите раствор взвешенных клеток в микропробирку для окрашивания ДНК.
2. Добавьте раствор красителя для окрашивания ДНК (например, Hoechst 33342) в 500 мкл раствора взвешенных клеток в микропробирке до конечной концентрации 1 мкг/мл. Затем подержите трубку в темноте в течение 10 минут.
3. Центрифугируйте в течение 1 минуты при давлении 2 000 x g для осаждения клеток. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 10 мкл 0,2 М раствора сахарозы для получения плотной клеточной суспензии.
4. Переложите 1 мкл раствора, содержащего витражи, на предметное стекло, наденьте крышку и наблюдайте с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного ультрафиолетовым (УФ) фильтром, используя линзу объектива с увеличением 100X и иммерсионное масло.
5. Подтвердите, что уплотнение ДНК наблюдается на этом этапе в большинстве клеток.

Материалы