Синтез антигенов мембранных белков, стабилизированных нанодисками, с использованием бесклеточной системы

Аннотация

Источник: Gilmore, S.F., et al. Бесклеточное масштабированное производство и адъювантное дополнение к рекомбинантному основному белку наружной мембраны из Chlamydia muridarum для разработки вакцин. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется бесклеточный синтез антигенов мембранных белков, стабилизированных нанодисками, с использованием двухкомпартментной системы. Устройство поддерживает оптимальные условия для эффективного синтеза белка, правильного сворачивания и стабильной интеграции в нанодиски.

Протокол

Бесклеточное производство основных частиц нанолипопротеинов на основе белка наружной мембраны — телодендримера (MOMP-tNLPs) для субъединичных лекарственных форм вакцин

1. Готовьте MOMP-tNLP бесклеточным методом.
   1. За два часа до начала бесклеточной реакции откройте набор для экспрессии прокариотического белка и разморозьте один из буферов для восстановления. После размораживания добавьте одну таблетку коктейля ингибиторов протеазы без этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и дайте ему полностью раствориться.

2. Следуйте этому протоколу с помощью набора, предназначенного для запуска 5 реакций по 1 мл.

   ЗАМЕТКА: Типичное масштабное производство составляет 3 x 1 мл.

   1. Для каждой реакции объемом 1 мл добавьте 525 мкл восстанавливающего буфера в флакон с лизатом кишечной палочки и осторожно перекатывайте до растворения. Добавьте 250 μL восстанавливающего буфера в бутылку, содержащую реакционные добавки (например, аденозинтрифосфат, гуанозинтрифосфат) и аккуратно скатайте до растворения.
   2. Добавьте 8,1 мл буфера для восстановления в бутылку с реакционной подачей, закройте резиновой пробкой (следите за тем, чтобы не касаться внутренней части резиновой пробки) и аккуратно переверните/прокатите, чтобы раствориться.
   3. Добавьте 3 мл восстановительного буфера в бутылку с аминокислотной смесью, закройте резиновой пробкой и аккуратно переверните/прокатайте до растворения.
      ЗАМЕТКА: Будьте осторожны, не прикасайтесь к внутренней стороне резиновой пробки, так как это может привести к загрязнению.
   4. Добавьте 1,8 мл восстановительного буфера во флакон с метионином, аккуратно прокатайте до растворения, а затем храните на льду до использования.
       
3. Приготовьте реакционный раствор.
   1. В флакон с лизатом E. coli добавьте 225 мкл восстановленной реакционной смеси, 270 мкл восстановленной аминокислотной смеси без метионина и 30 мкл восстановленного метионина. Кроме того, добавьте 400 мкл смеси 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DMPC)/телодендримера, 15 мкг плазмиды MOMP и 0,6 мкг плазмиды Δ49ApolipoproteinA1. Скатайте/аккуратно встряхните, чтобы перемешать.
      ЗАМЕТКА: Убедитесь, что обе плазмиды сконструированы из одной и той же плазмидной магистрали. Не делайте вихрей.
   2. Возьмите 20 мкл от общего количества раствора и отложите его в пробирку объемом 1,5 мл для контрольной реакции, экспрессирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP) (см. ниже).
       
4. Приготовьте кормовой раствор. В флакон с кормовой смесью добавьте 2,65 мл восстановленной аминокислотной смеси без метионина и 300 мл восстановленного метионина. Скатайте/осторожно встряхните, чтобы раствориться.
   ЗАМЕТКА: В это время неиспользованный восстановительный буфер и метионин могут быть возвращены в морозильную камеру для хранения.
    
5. Перелейте 1 мл реакционного раствора во внутреннюю реакционную камеру, входящую в комплект для бесклеточной реакции, и запечатайте после заполнения. Перенесите 10 мл исходного раствора во внешнюю камеру реакционного сосуда и закупорку.
   ЗАМЕТКА: Не переполняйте камеры! Наличие пузырьков воздуха в верхней части как внутренней реакционной камеры, так и внутренней камеры подачи отрицательно скажется на реакции. Любой оставшийся реакционный раствор можно поместить в пробирку объемом 1,5 мл и дать ему перемешаться рядом с основным сосудом.
    
6. Добавьте 0,5 мкл контрольной плазмиды GFP (0,5 мг/мл) к ранее аликвотированной реакционной смеси объемом 20 мкл.
   ЗАМЕТКА: Многие комплекты поставляются с контрольной плазмидой для контроля качества. Большинство плазмид GFP, экспрессирующих с промотором T7 и сайтом связывания рибосомы E.coli (RBS), также могут быть использованы в качестве контрольной плазмиды.
    
7. Поместите реакцию в шейкер при 300 об/мин, 30 °C на срок до 18 часов. Чтобы убедиться в том, что реакция прошла успешно, используйте источник ультрафиолетового излучения для проверки флуоресценции из-за синтеза контрольного GFP (рис. 1) уже через 15 минут инкубации.
   ЗАМЕТКА: Эти условия, особенно температура, могут нуждаться в оптимизации для экспрессии других мембранных белков.

Результаты

Рисунок 1: Экспрессия и очистка MOMP-tNLP. (A) Изображение пробирок, содержащих небольшие аликвоты бесклеточной реакции, которая успешно экспрессировала контроль GFP при свечении под ультрафиолетовым источником света...

Материалы