Вестерн-блоттинг для оценки структурной целостности бактериального вакцинного антигена

Аннотация

Источник: Gilmore, S.F. et al. Бесклеточное масштабированное производство и адъювантное дополнение к рекомбинантному основному белку наружной мембраны из Chlamydia muridarum для разработки вакцин. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется использование вестерн-блоттинга для оценки структурной целостности основного белка внешней мембраны (MOMP) в вакцинных комплексах на основе наночастиц. В нем описаны ключевые этапы, связанные с переносом белка, мечением антител и флуоресцентной визуализацией.

Протокол

1. Вестерн-блот

1. Для вестерн-блоттинга растворите основной белок наружной мембраны (MOMP) – частицы нанолипопротеинов телодендримера (tNLP) с помощью SDS-PAGE и перенесите гели с помощью коммерческой системы сухого блоттинга со стандартными настройками в соответствии с протоколом производителя.
   1. После завершения переноса удалите блоты из стопки и инкубируйте каждый блот в течение ночи при 4 °C в подходящем блокирующем буфере, содержащем 0,2% Tween 20 и либо 0,5 мг/мл моноклонального антитела (MAb) 40, либо 0,2 мг/мл антитела MAbHIS против His-tag, направленного против His-метки из белка Δ49ApoA1.
      ЗАМЕТКА: Разведения антител, используемые для блоттинга, составляют 1:1000 для MAb40 и 1:500–1000 для антител MAbHIS.
   2. Промойте каждую промокашку 3 раза в течение 5 минут PBS-T (1x фосфатно-солевой буфер (PBS), 0,2% Tween 20, pH 7,4).
   3. Инкубируйте блоттинги в течение 1 ч в блокирующем буфере, содержащем вторичное антитело, конъюгированное с флуорофором (например, инфракрасным красителем (IRDye)) в соотношении 1:10000.
   4. Повторно промойте кляксы 3 раза в течение 5 минут PBS-T. Используйте флуоресцентный тепловизор для получения изображений клякс после окончательного мытья.

Материалы