Подготовка и трансформация бактерий с помощью высоковольтной электропорации

Аннотация

Источник: Стефан, А., и др., Многогранные преимущества коэкспрессии белка в кишечной палочке. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео показана процедура трансформации Escherichia coli в плазмиду, несущую ген устойчивости к антибиотикам, включая подготовку клеток, электропорацию, восстановление и выбор трансформантов.

Протокол

1. Выделение котрансформантов E. coli

1. Подготовьте электрокомпетентные клетки соответствующего штамма кишечной палочки для трансформации. Перенесите в 1 мл среды Luria-Bertani (LB) (триптон, дрожжевой экстракт, NaCl в концентрации 10, 5 и 10 г/л соответственно) одну колонию выбранного штамма и инкубируйте при 37 °C при встряхивании со скоростью 180 об/мин. Разведите предварительную культуру в соотношении 1:500 в 25 мл свежей среды LB и инкубируйте культуру при 37 °C.
2. В логарифмической фазе (0,6 O.D. или оптическая плотность) центрифугируйте клеточную суспензию при 5000 x g в течение 20 мин и повторно суспендируйте гранулу в 10%, v/v ледяную стерильную глицериновую воду в половине исходного объема культуры. Повторите этот шаг 4 раза, уменьшив объем ресуспензии вдвое. Наконец, повторно суспендируйте гранулу в глицерине/воде и разделите клеточную суспензию на 50 мкл аликвот. Хранить аликвоты при температуре -80 °C до 6 месяцев.
3. Растворите нужную плазмиду в стерильной воде с добавлением 0,5 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). Разморозьте аликвоту электрокомпетентных клеток на льду и смешайте с соответствующим количеством (2,5-5 нг) вектора. Дозируйте смесь в кювету диаметром 0,1 см, пригодную для электропорации, и приложите напряжение 1,8 кВ.
4. Немедленно перенесите электропорированные клетки в 1 мл среды SOC (супероптимальный бульон с подавлением катаболитов) (среда LB с добавлением 0,2% w/v глюкозы, 10 mM MgCl₂, 2,5 mM KCl), инкубируйте в течение 1 часа при встряхивании и, наконец, перенесите 100 μl аликвот в чашки Петри, содержащие LB-агар с соответствующим антибиотиком. Инкубировать O/N при 37 °C.
5. Очистите трансформанты, нанеся полосы на отдельные колонии на чашки Петри.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агар	Сигма-Олдрич	А1296
Ампициллин	Сигма-Олдрич	А9518
ЭДТА	Сигма-Олдрич	ЭЦП
Глицерин	Сигма-Олдрич	Г5516
KCl	Сигма-Олдрич	П9541
MgCl₂	Сигма-Олдрич	М2670
NaCl	Сигма-Олдрич	31434
Триптон	Сигма-Олдрич	95039
Дрожжевой экстракт	Флюка	70161
Кюветы 0,1 см	БиоРад	1652089	Для электропорации
Центрифуга 5415R	Эппендорф
Центрифуга Allegra 21R	Бэкмен
Электропорация Gene Pulser II	БиоРад