Оценка частоты мутаций у бактерий с помощью анализа на бета-глюкозидазу

Аннотация

Источник: Stefan, A., et al. Многогранные преимущества совместной экспрессии белка в кишечной палочке. J. Vis. Exp. (96), (2015).

В этом видео показана оценка частоты мутаций у бактерий с помощью анализа бета-глюкозидазы. Бактериальные культуры, экспрессирующие ДНК-полимеразу, испытывающую дефицит корректуры, собираются в течение последующих поколений. Ошибки репликации, вызванные сокращением корректуры, могут активировать подавленный ген бета-глюкозидазы. После центрифугирования и пермеабилизации добавляют субстрат и измеряют активность фермента для количественной оценки частоты мутаций в образцах.

Протокол

1. Выделение котрансформантов Escherichia coli или E. coli

1. Подготовьте электрокомпетентные клетки соответствующего штамма кишечной палочки для трансформации. Перенесите в 1 мл среды Luria-Bertani (LB) (триптон, экстракт дрожжей, хлорид натрия или NaCl в концентрации 10, 5 и 10 г/л соответственно) одну колонию выбранного штамма и инкубируйте при 37 °C при встряхивании 180 об/мин. Разведите предварительную культуру в соотношении 1:500 в 25 мл свежей среды LB и инкубируйте культуру при 37 °C.
2. В логарифмической фазе (0,6 O.D.) центрифугируют клеточную суспензию при 5000 x g в течение 20 мин и повторно суспендируют гранулу в 10%, v/v ледяной стерильной глицериновой воды в половине исходного объема культуры. Повторите этот шаг 4 раза, каждый раз уменьшая объем ресуспензии вдвое. Наконец, повторно суспендируйте гранулу в глицерине/воде и разделите клеточную суспензию на 50 мкл аликвот. Хранить аликвоты при температуре -80 °C до 6 месяцев.
3. Растворите нужную плазмиду в стерильной воде с добавлением 0,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Разморозьте на льду аликвоту электрокомпетентных клеток и смешайте с соответствующим количеством (2,5-5 нг) вектора. Разложите смесь в кювету диаметром 0,1 см, подходящую для электропорации, и приложите напряжение 1,8 кВ.
4. Немедленно перенесите электропорированные клетки в 1 мл супероптимального бульона со средой для подавления катаболитов (SOC) (среда LB с добавлением 0,2% w/v глюкозы, 10 мМ хлорида магния или MgCl₂, 2,5 мМ хлорида калия или KCl), инкубируйте в течение 1 часа при встряхивании и, наконец, переложите 100 мкл аликвот в чашки Петри, содержащие LB-агар с соответствующим антибиотиком. Инкубировать в течение ночи (O/N) при 37 °C.
5. Очистите трансформанты, нанеся полосы на отдельные колонии на чашки Петри.
6. Подготовьте электрокомпетентные ячейки первичных трансформантов и повторите шаги с 1.1 по 1.5 для трансформации с дальнейшими плазмидами.
7. Подготовьте запасы глицерина ко-трансформантов. Перенесите одну колонию в LB с добавлением соответствующих антибиотиков, инкубируйте при 37 °C при встряхивании, а при логарифмической фазе (0,6 O.D.) центрифугируйте клеточную суспензию при 5000 x g в течение 20 минут. Ресуспендировать гранулу в среде LB-антибиотиков, содержащей 15% v/v глицерина. Разложить в аликвоты и хранить при температуре -80 °C.

2. Мутационный анализ популяций, совместно экспрессирующих ε субъединицу ДНК-полимеразы III E. coli дикого типа и мутагенный вариант εD12A

1. Перенесите одну колонию E. coli TOP10, содержащую векторы pBAD-ε и pGOOD1-εD12A, в 1 мл среды LB-антибиотиков. Инкубировать O/N при 37 °C.
2. Разведите предварительную культуру в соотношении 1:250 в 3 колбах, содержащих свежую среду (10 мл), добавьте соответствующие индукторы (арабинозу, изопропил β-d-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) или арабинозу и ИПТГ, по 1 мМ каждая) и инкубируйте при 37 °С в течение 8 ч. Параллельно готовьте неиндуцированные культуры.
3. Соберите аликвоты по 1 мл, затем разведите 1:500 в новых колбах, содержащих свежую среду (10 мл) с добавлением или без добавления соответствующих индукторов. Инкубировать O/N при 37 °C.
4. Повторите шаги 2.2 и 2.3 и соберите аликвоты по 1 мл.
5. Определите количество поколений, которые произошли в каждой культуре. Перенесите на планшеты LB 100 мкл соответствующих последовательных разведений инокулята и культуры. Инкубируйте O/N при 37 °C. Подсчитайте колонии на планшетах LB и рассчитайте логарифм количества клеток, присутствующих в посевном материале (log_I) и в культуре в конце роста (log_C). Чтобы определить количество поколений, используйте формулу: (log_C– log_I)/0,301.
6. Центрифугируйте при 5000 x g в течение 20 мин и ресуспендируйте клетки в 1 мл 50 мМ трис(гидроксиметил)аминометана гидрохлорида (Tris-HCl), pH 7,6, 50 мМ NaCl. Чтобы пропитать клетки, добавьте 2-3 капли хлороформа и вортекса на 20 секунд.
7. Определите активность β-глюкозидазы каждой аликвоты в 96-луночном микропланшете, используя в качестве субстрата-нитрофенил-β-D-глюкопиранозид (PNPGluc). Добавьте в каждую лунку 100 μл пермеабилизированных клеток и 100 μл субстрата (16 мг/мл стокового раствора в воде или H₂O). Следите за тем, чтобы в лунках не было пузырьков воздуха. Считывайте абсорбцию на длине волны 420 нм, используя считыватель микропланшетов и соответствующий фильтр.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агар	Сигма-Олдрич	А1296
Ампициллин	Сигма-Олдрич	А9518
Хлороформ	Сигма-Олдрич	288306
ЭДТА	Сигма-Олдрич	ЭЦП
Глицерин	Сигма-Олдрич	Г5516
ИПТГ	Сигма-Олдрич	И5502
KCl	Сигма-Олдрич	П9541
L-арабиноза	Сигма-Олдрич	А3256
MgCl₂	Сигма-Олдрич	М2670
NaCl	Сигма-Олдрич	31434
ПМСФ	Сигма-Олдрич	П7626
PNP-gluc	Сигма-Олдрич	Н7006
Тетрациклин	Сигма-Олдрич	87128
База Тризма	Сигма-Олдрич	Т1503
Триптон	Сигма-Олдрич	95039
Дрожжевой экстракт	Флюка	70161
Кюветы 0,1 см	БиоРад	1652089	Для электропорации
Центрифуга 5415R	Эппендорф
Центрифуга Allegra 21R	Бэкмен
Хроматографическая установка GradiFrac	Фармация Биотех
Электропорация Gene Pulser II	БиоРад
Считыватель микропланшетов 550	Биорад
МиниПротеан 3 ячейки	БиоРад
Электропитание	БиоРад