Экстракция и очистка пластоглобулов от фотосинтезирующих бактерий

Аннотация

Источник: Шивайя, К., и др. Выделение липидных капель пластоглобула из тканей листьев растений и цианобактерий. J. Vis. Exp. (2022)

На видео демонстрируется выделение пластоглобул из цианобактерий. Он начинается с культивирования цианобактерий и проходит через разрушение клеток с помощью механической силы. Высвобождение фотосинтетических пигментов свидетельствует об успешном лизисе. Затем используется ступенчатый градиент сахарозы для разделения клеточных компонентов по плотности, что позволяет пластоглобулам, работающим с низкой плотностью, образовывать отчетливую полосу в верхней части. Эта фракция собирается и сохраняется для дальнейшего анализа.

Протокол

1. Выделение сырых пластоглобул

1. Экстракция сырых пластоглобулов из цианобактерий
   1. Вырастите 50 мл культуры Synechocystis sp. PCC 6803 до стационарной фазы (около 7-10 дней) и отрегулируйте плотность клеток до оптической плотности при 750 нм (OD₇₅₀) 2,0 с помощью спектрофотометра. Для условий культивирования используют среды BG-11 и выращивают в инкубаторе при интенсивности света 150 μмоль фотонов/^м2/с, 2% CO₂, 32 °C и при непрерывном встряхивании со скоростью 150 оборотов в минуту (об/мин).
   2. Для удаления полисахаридов необходимо промыть клетки путем центрифугирования культуры объемом 50 мл при 6000 × г в течение 45 мин при 4 °C и последующего удаления надосадочной жидкости. Продолжайте промывать клетки дважды в 50 мл буфера А (Таблица 1). Удалите аликвоту гомогената клеток и отложите ее в сторону перед центрифугированием, чтобы сохранить в качестве репрезентативного общего образца клеток.
   3. Повторно суспендируйте промытую гранулу в 25 мл буфера А и разбейте ячейки с помощью французской ячейки давления при давлении 1100 фунтов на квадратный дюйм (фунтов на квадратный дюйм), повторяя процесс 3× (помещайте образец на лед между каждым циклом, чтобы избежать денатурации белка) до тех пор, пока лизированный цвет не изменится с зеленого на красно-сине-зеленый под белым светом. Используйте предварительно охлажденную камеру и выполняйте этот этап в холодильной камере.
   4. Распределите полученный гомогенат между восемью ультрацентрифужными пробирками объемом 3 мл, заполненными максимум до 2,5 мл в каждой пробирке, а затем тщательно насыпьте 400 мкл среды R, создавая ступенчатый градиент.
   5. Тщательно сбалансируйте пробирки, добавив при необходимости дополнительную среду R, и центрифугируйте в течение 30 минут при 150 000 × г при 4 °C. Тилакоид и другие более тяжелые органеллы (включая любые полигидроксиалканоатные тельца) будут гранулироваться, в то время как пластоглобулы будут легко видны в виде желтой маслянистой подушечки на вершине градиента сахарозы или рядом с ней (рис. 1C).
   6. Соберите полученную плавающую прокладку из сырых пластоглобулов с помощью шприца и иглы 22G и поместите в пробирку объемом 2 мл. При необходимости соскребите пластоглобулы со стороны стенки ультрацентрифужной пробирки кончиком иглы.
   7. Перейдите к шагу 2.2. В качестве альтернативы можно хранить необработанные пластоглобулы при температуре -80 °C и позже очищать.

Таблица 1: Буферные рецепты для выделения пластоглобулов из тканей листьев растений или цианобактерий.

Буферные композиции а
Буфер для измельчения	50 мМ HHEPES-Koh (pH 8,0)
	5 мМ хлорида магния (MgCl2)
	100 мМ сорбита
	5 мМ аскорбиновой кислоты b
	5 мМ восстановленный цистеин b
	0,05 % (по мас.) Бычий сывороточный альбумин (BSA) b
Средний R	50 мМ HHEPES-Koh (pH 8,0)
	5 мМ MgCl2
Средний R 0,2	50 мМ HHEPES-Koh (pH 8,0)
	5 мМ MgCl2
	0,2 м сахарозы
Средний R 0,7	50 мМ HHEPES-Koh (pH 8,0)
	5 мМ MgCl2
	0,7 м сахарозы
Буфер А	25 мМ HHEPES-Koh (pH 7,8)
	250 мМ сахароза
a. Приведены конечные концентрации каждого буферного компонента.
b. Необходимо добавить свежий в день изоляции. В то время как буферные растворы могут быть приготовлены за день до изоляции, некоторые ингредиенты должны быть добавлены в свежем виде в день изоляции, а также любые ингибиторы фосфатазы и протеазы.

2. Сбор чистых пластоглобул

1. Обработка цианобактерий
   1. Получить градиент сахарозы в четырех ультрацентрифужных пробирках объемом 2,5 мл, предварительно покрытых 500 мкл необработанных пластоглобул из стадии 1.3, смешанных с 750 мкл среды R 0,7, затем покрытых 750 мкл среды R 0,2.
   2. Центрифугируйте градиент сахарозы при 150 000 × г в течение 90 мин при 4 °C. Соберите чистые пластоглобулы (рис. 1C) с помощью шприца и иглы 22 G из верхней фазы градиента сахарозы и перенесите в пробирку объемом 1,5 мл.
   3. Аликотируйте чистые пластоглобулы и мгновенно заморозьте в жидком азоте. Хранить непосредственно при температуре −80 °C или лиофилизировать до состояния сухого порошка.

Результаты

Рисунок 1: Выделение и иммуноблоттинг пластоглобулов и тилакоидов. (А) Репрезентативный очищенный образец пластоглобула от Z. mays перед экстракцией из градиента сахарозы. (B) Репрезентативный образец...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аскорбате	BDH	BDH9242
Бычий сывороточный альбумин	Пролиант Биологический	68700
Французский нагреватель давления (модель FA-079)	SLM/Aminco	Н/Д
ХЕПЕС	Сигма Олдрич	Н3375
Хлорид магния	Сигма Олдрич	М8266
Встряхивающий инкубатор Multitron	Инфорс ХТ	Н/Д
Едкое кали	Фишер Кемикалс	М16050
Пониженный цистеин	МП Биохимикаты	101444
Сорбит	Сигма Олдрич	С3889
Сахароза	Сигма Олдрич	С9378
Synechocystis sp. PCC 6803	Н/Д	Н/Д
Ультрацентрифуга Optima MAX-TL	Бекман Коултер	А95761