Градиентная очистка цианобактериальных пластоглоглулов градиентом плотности

Аннотация

Источник: Шивайя, К., и др. Выделение липидных капель пластоглобула из тканей листьев растений и цианобактерий. J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео демонстрируется выделение пластоглобуль из цианобактерий с помощью центрифугирования градиента плотности сахарозы, что подчеркивает их богатую липидами природу низкой плотности и обеспечивает их структурную сохранность для последующего анализа.

Протокол

1. Забор чистых пластоглобул

1. Обработка цианобактерий
   1. Получить градиент сахарозы в четырех ультрацентрифужных пробирках объемом 2,5 мл, предварительно наложив 500 мкл необработанных пластоглобул из стадии 1,3, смешанных с 750 мкл среды R 0,7, затем покрыть 750 мкл среды R 0,2 (таблица 1)
   2. Центрифугируйте градиент сахарозы при 150 000 x g в течение 90 мин при 4 °C. Соберите чистые пластоглобулы (рис. 1C) с помощью шприца и иглы 22 G из верхней фазы градиента сахарозы и перенесите в пробирку объемом 1,5 мл.
   3. Аликотируйте чистые пластоглобулы и мгновенно заморозьте в жидком азоте. Хранить непосредственно при температуре −80 °C или лиофилизировать до сухого порошка.

Таблица 1: Буферные рецепты для выделения пластоглобулов из цианобактерий.

Средний R	50 мМ HHEPES-Koh (pH 8,0)
	5 мМ MgCl2
Средний R 0,2	50 мМ HHEPES-Koh (pH 8,0)
	5 мМ MgCl2
	0,2 м сахарозы
Средний R 0,7	50 мМ HHEPES-Koh (pH 8,0)
	5 мМ MgCl2
	0,7 м сахарозы

Результаты

Рисунок 1: Выделение и иммуноблоттинг пластоглобулов и тилакоидов. (А) Репрезентативный очищенный образец пластоглобула от Z. mays перед экстракцией из градиента сахарозы. (B) Репрезентативный образец...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ХЕПЕС	Сигма Олдрич	Н3375
Хлорид магния	Сигма Олдрич	М8266
Сахароза	Сигма Олдрич	С9378
Synechocystis sp. PCC 6803	Н/Д	Н/Д
Ультрацентрифуга Optima MAX-TL	Бекман Коултер	А95761