$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Кормление червей живыми бактериями в жидкой культуре
ЗАМЕТКА: Этот протокол используется для колонизации червей выращенными в лаборатории бактериями в хорошо перемешанных условиях в жидкой культуре. Черви могут быть колонизированы отдельными изолятами из чистой культуры (например, патогенами, такими как Enterococcus faecium) или смесями изолятов (например, минимальными сообществами микробиома).
- Начните с промытых сахарозой синхронизированных взрослых червей в конической пробирке объемом 15 мл. Промойте червей один раз в 12 мл S буфера и выбросьте надосадочную жидкость.
- Суспендируйте промытых червей в необходимом для эксперимента объеме S-среды. Рассмотрим объем экспериментальных условий, количество условий, при которых черви будут разделены, и конечные концентрации червей и бактерий.
ЗАМЕТКА: Кормление червей зависит от наличия бактерий, и черви могут испытывать стресс из-за скученности. Для колонизации в жидкой культуре рекомендуется <1000 червей/мл и >107 КОЕ/мл; 1011 КОЕ/мл считается «ad libitum» кормовой плотностью для E. coli. - Откручивайте бактериальные культуры вниз. Слейте надосадочную жидкость; Аспирация или пипетирование могут использоваться для удаления надосадочной жидкости для бактерий, образующих рыхлые гранулы.
ЗАМЕТКА: Для культур >5 мл переложите в пробирки объемом 15 мл и вращайте при ~2800 x g в большой настольной центрифуге в течение 8-10 минут. Культуры <5 мл можно перелить в пробирки объемом 1,5 мл и центрифугировать при плотности 9000 x g в течение 1-2 мин в небольшой настольной центрифуге. Высокоподвижные бактерии (например, многие виды Pseudomonas) могут нуждаться в охлаждении при 4 °C в течение 10-15 минут, чтобы способствовать образованию стабильной гранулы, и может быть лучше центрифугировать при 4 °C. - Ресуспендировать бактериальные культуры в одном объеме S-буфера и снова центрифугировать в гранулы. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость, как и раньше.
- Ресуспендируйте бактериальные культуры в среде S с желаемой плотностью для эксперимента, а также любые антибиотики для выбора. Выбор антибиотиков, если таковые будут использоваться, будет зависеть от профиля резистентности бактерий, используемых для колонизации.
- С помощью наконечника пипетки, покрытого червячным буфером M9 с добавлением 0,01% Triton X-100 (M9TX-01), червячки-пипетки осторожно поднимаются и опускаются до тех пор, пока черви полностью не будут повторно суспендированы в среде S, а затем переносят в пробирки или лунки планшетов для бактериальной колонизации.
- Добавляйте бактериальную суспензию к каждой культуре червей для достижения желаемой бактериальной концентрации и конечного объема.
- Если для колонизации используется многолуночная пластина, накройте пластину стерильной 96-луночной газопроницаемой герметизирующей мембраной.
- Инкубируйте с встряхиванием при 200 об/мин, чтобы предотвратить оседание бактерий во время инкубации.
2. Механическое разрушение отдельных шнеков в формате 96 лунок
ЗАМЕТКА: В этом разделе описан протокол в формате 96-луночного планшета для механического разрушения отдельных бактериально колонизированных C. elegans. Первые шаги в протоколе описывают метод очищения кишечника червей от неприлипших бактерий и очистки наружной поверхности червей с помощью холодового паралича и поверхностного отбеливания. На этих этапах будут получены чистые, живые взрослые черви, которые могут быть механически разрушены для количественного определения содержания бактерий или использованы для дальнейших экспериментов. Этот протокол может быть адаптирован для количественного определения бактерий у червей, колонизированных в жидкой культуре, на агаровых планшетах или из естественной или микромирной почвы.
- Положите аликвоту M9TX-01 на лед для охлаждения (в 4-5 раз больше образцов в мл).
- Приготовьте аликвоту M9TX-01 + отбеливатель (6% гипохлорита натрия, 1:1000 или 1:2000 об., 1 мл на образец + 1 мл дополнительно) и положите на лед для охлаждения.
- Повторно суспендируйте каждый образец червя в 1 мл M9TX-01 в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.
- Кратковременно (2-3 с) вращают пробирки в низкооборотистой миницентрифуге (2 000 x g) при температуре 25 °C для гранулирования взрослых особей. Отсоедините надосадочную жидкость и выбросьте, следя за тем, чтобы не потревожить гранулу от червя.
- Используя центрифугирование, дважды промойте червей 1 мл M9TX-01, затем один раз 1 мл буфера для червей M9, чтобы уменьшить количество внешних бактерий.
- Очистите кишечник от неприлипших бактерий из кишечника червей.
- Повторно суспендируйте каждый образец червей в 1 мл среды S + 2x убитого при нагревании OP50 в пробирке для культивирования.
- Инкубируйте при температуре 25 °C в течение 20-30 минут, чтобы обеспечить выход любых неприлипших бактерий из кишечника.
ЗАМЕТКА: Это также удалит любой внеклеточный флуоресцентный белок из просвета и позволит более четко визуализировать меченые бактерии, прилипшие к кишечному эпителию, особенно при использовании кислотоустойчивых флуорофоров (например, mCherry, dsRed).
- Поверхность отбеливайте червей, чтобы очистить от внешних бактерий.
- Дважды промойте продуваемых червей 1 мл холодного M9TX-01 и выбросьте надосадочную жидкость.
- Дайте пробиркам остыть в течение 10 минут на льду (предпочтительно) или при температуре 4 °C. Это парализует глистов и предотвратит попадание в организм отбеливателя.
ЗАМЕТКА: В других протоколах используется химическое вещество для паралича, такое как левамизол; Это устоявшийся подход, который требует добавления потока опасных отходов. - Добавьте 1 мл ледяного червячного буфера M9 + отбеливатель без запаха (8,25% гидроксида натрия, 1:1000 или 1:2000 v/v) в каждую пробирку. Дайте трубкам постоять на льду (предпочтительно) или при температуре 4 °C не менее 10 минут, чтобы убить внешние бактерии.
ЗАМЕТКА: Концентрация отбеливателя не должна превышать 1:1000. Даже у парализованных червей может наступить смертность. - Отбеливайте буфер пипеткой и выбросьте; Верните трубки в лед, чтобы черви не возобновили откачку до тех пор, пока отбеливатель не будет очищен.
- Добавьте по 1 мл холодного M9TX-01 в каждую пробирку. Отжим в течение ~5 с в миницентрифуге (2 000 x g при 25 °C); Возвращать трубки в лед. Удалите надосадочную жидкость и выбросьте.
- Повторите этот этап промывки еще 1 мл холодной жидкости M9TX-01, отбросив как можно больше надосадочной жидкости.