Механическое разрушение отдельных червей для оценки изменчивости взаимодействий хозяина и бактерии

Аннотация

Источник: Taylor, M.N. et al. Использование данных по одному червю для количественной оценки гетерогенности взаимодействий Caenorhabditis elegans и бактерий. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео показана количественная оценка вариабельности кишечной бактериальной нагрузки у отдельных Caenorhabditis elegans за счет механических нарушений. В нем описаны этапы подготовки образцов, механического разрушения, серийного разведения и подсчета колоний для оценки различий в бактериальной нагрузке кишечника среди отдельных червей.

Протокол

1. Отделите червячки в глубокую 96-луночную пластину с зернистостью из карбида кремния для механического разрушения. Подготовьте пластину для разрушения на 96 лунок следующим образом.
   1. Приобретите стерильный 96-луночный планшет объемом 2 мл и подходящую кремниевую 96-луночную крышку.
      ЗАМЕТКА: Важно использовать планшеты, совместимые с 96-луночными адаптерами для тканевого разрушителя. Крошечные различия во внешних размерах определяют разницу между пластиной, которую можно снять с адаптеров, и пластиной, которую нельзя снять.
   2. С помощью стерильного совкового шпателя добавьте небольшое количество стерильного карбида кремния 36-й зернистостью в каждую лунку пластины, на которую будет приниматься червь. Используйте достаточное количество песка, чтобы едва покрывать дно лунки (около 0,2 г на лунку). Избыток материала затруднит попадание наконечника пипетки на дно лунки при извлечении содержимого.
   3. Добавьте в каждую лунку по 180 мкл червячного буфера M9.
   4. Пометьте столбцы или строки, чтобы указать, куда будет отправляться каждый образец, затем неплотно накройте пластину кремниевой 96-луночной крышкой.
2. Перенесите отдельные черви на 96-луночный планшет для разрушения.
   1. Осторожно переместите проникших червей в небольшую (35 или 60 мм) чашку Петри, содержащую достаточное количество буфера для червей M9, добавленного 0,01% Triton X-100 (M9TX-01), чтобы заполнить чашку на глубину ~1 см.
      ЗАМЕТКА: Если присутствует большое количество червей, может оказаться нецелесообразным перенести весь образец, так как жидкость станет скученной, и будет трудно пипетировать отдельных червей.
   2. С помощью препарирующего микроскопа или другого устройства с малым увеличением отпидайте отдельные черви объемом 20 мкл и перенесите этих червей в отдельные лунки 96-луночного планшета.
      ЗАМЕТКА: Лучше всего заготавливать только свежеубитых червей. Избегайте червей с жесткой, линейной формой, так как эти черви могли быть мертвы в течение некоторого времени. Старайтесь брать червей изогнутой или S-образной формы, с нормальной грубой физиологией и неповрежденным кишечником.
   3. После переноса каждого объема убедитесь, что выбранный червяк действительно был выброшен в скважину. Для этого пипетируйте 20 мкл M9TX-01 из прозрачной области чашки Петри и выпустите весь объем обратно в чашку; Обычно это приводит к выбросу червя, если он прилип к пипетке. Если червь застрял, извлеките 20 мкл из лунки и повторите попытку пересадки.
   4. После того, как все черви будут перенесены, накройте 96-луночный планшет листом имеющейся в продаже гибкой герметизирующей пленки на бумажной основе (2 x 2 квадрата), убедившись, что сторона герметизирующей пленки с бумажной подложкой обращена вниз к лункам для образцов. Будьте осторожны, чтобы не растянуть уплотнительную пленку слишком тонко, иначе ее будет очень сложно снять впоследствии.
   5. Слегка положите силиконовый уплотнительный коврик поверх гибкой герметизирующей пленки; В это время не вдавливайте крышку в лунки.
   6. Переместите тарелку на 4 °C для охлаждения в течение 30-60 минут. Это предотвратит перегрев при разрушении, который может повредить образцы.
      ЗАМЕТКА: Это точка разрыва в протоколе. В большинстве случаев пластину можно оставить при температуре 4°C на срок до 4 часов перед шлифованием. Не оставляйте червей на ночь, так как это изменит количество бактерий.
3. Загрузите 96-луночные планшеты в тканевый разрушитель, чтобы разрушить ткани червей и выпустить кишечные бактерии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) Если для дижестов используется нечетное количество 96-луночных планшетов, необходимо подготовить противовес, прежде чем продолжить. Используйте пустую глубокую 96-луночную пластину и наполняйте лунки водой, пока она не станет весить столько же, сколько первая пластина.
   1. Плотно вдавите силиконовый уплотнительный коврик в лунки, чтобы создать уплотнение, убедившись, что крышка ровно лежит по всей поверхности пластины.
      ЗАМЕТКА: Если гибкая герметизирующая пленка после растяжения будет слишком толстой, будет трудно закрепить силиконовую крышку так, чтобы она лежала ровно во всех лунках. Это приведет к недостаточному уплотнению и загрязнению скважины во время встряхивания.
   2. Закрепите пластины в тканевом разрушителе с помощью адаптеров для планшетов на 96 лунок. Встряхивайте пластины в течение 1 минуты с частотой 30 Гц, затем поверните пластины на 180° и снова встряхивайте в течение 1 минуты. Это поможет обеспечить равномерное нарушение работы всех скважин плиты.
   3. Сильно постучите пластинами по скамейке два или три раза, чтобы удалить песок с гибкой герметизирующей пленки.
   4. Используя большую центрифугу с двумя адаптерами для 96-луночных планшетов, вращайте планшеты при давлении 2400 x g в течение 2 минут, чтобы собрать весь материал на дно лунок.
   5. Снимите силиконовую крышку и осторожно снимите гибкую уплотнительную пленку.
      ЗАМЕТКА: Если гибкая герметизирующая пленка застряла в какой-либо из лунок, удалите ее с помощью наконечника для дозатора объемом 200 мкл. Это обычное явление, когда гибкая уплотнительная пленка натянута слишком тонко.
4. Последовательно разбавляйте образцы червя в 300 мкл в 96-луночных планшетах.
   1. С помощью многолуночного дозатора объемом 200 мкл медленно и осторожно проводите пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы повторно перемешать содержимое лунок, а затем удалите как можно больше жидкости. Перенесите эту жидкость в верхние ряды 96-луночных планшетов, подготовленных для серийного разведения поврежденных образцов червя.
   2. Используя 96-луночный пипеттор объемом 20 мкл, удалите этот объем жидкости из верхнего ряда и распределите в ряд В. Перемешайте пипетку вверх и вниз в 8-10 раз. Отбросьте кончики.
   3. Повторите шаг 4.2, начиная с 0,1x образцов в строке B, чтобы создать 0,01x образцы разведения в строке C.
   4. Повторите шаг 4.2 еще раз, переходя от ряда C к ряду D.
   5. Нанесите пластину на твердый агар для количественного определения бактерий. Для моноколонизированных червей, как правило, достаточно нанести 10-20 мкл капель каждого разведения [1x-0,001x] на агаровые планшеты. Для многовидовой колонизации каждый разведенный препарат следует наносить отдельно, пипетируя 100 мкл на агаровую пластину толщиной 10 см; Разложите сразу с помощью стеклянных гальванических бусин.

Материалы