Количественная оценка полярности и динамики компонента системы секреции у Legionella pneumophila

Аннотация

Источник: Chetrit, D., et al. Применение визуализации живых клеток и криоэлектронной томографии для определения пространственно-временных особенностей системы секреции Legionella pneumophila dot/icm. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео демонстрируется использование флуоресцентной визуализации живых клеток для количественной оценки полярности и динамики компонентов системы секреции у Legionella pneumophila, что позволяет анализировать пространственное рекрутирование и цитозольное перераспределение, имеющее решающее значение для понимания бактериального патогенеза

Протокол

1. Количественная оценка полярной локализации и динамики точечных/Icm компонент

ЗАМЕТКА: Следующие шаги предназначены для изображений с разрешением 0,129 мкм на пиксель, полученных с помощью биннинга 2 x 2.

1. Количественное определение полярности гибридных белков sfGFP (superfolder green fluorescent protein) (Рисунок 1)
   1. Отрегулируйте контрастность изображения так, чтобы бактерии были хорошо видны. С помощью инструмента «Регион» поместите прямоугольник размером 0,25 x 1,3^мкм2 , начинающийся от полюса и продолжающийся в цитоплазму. Прямоугольник должен оставаться точно в пределах бактериальных границ.
   2. Отметьте не менее 200 бактерий и используйте кнопку « Регион для маски », чтобы создать маски для интересующих областей. В разделах «Статистика маски » и «Область маски» выберите «Объект». Затем в разделе Особенности и интенсивность отметьте Средняя интенсивность и дисперсия.
   3. Экспортируйте данные и рассчитайте оценки полярности каждой бактерии как отношение между дисперсией и средней интенсивностью.
   4. В приложениях с высокой пропускной способностью используйте фазовый объектив и соответствующую концепцию конденсатора для получения изображений с фазовым каналом и каналом 488 нм. Обязательно выбирайте поля зрения, где бактерии полностью отделены.
   5. Отрегулируйте контрастность фазового канала изображения до уровня, при котором бактерии будут четко видны. Откройте изображение с двумя каналами, запустите окно «Создать маску сегмента » и измените канал на фазу.
   6. Настройте подходящий порог и удалите мелкие объекты с помощью кнопки «Определить объекты ». В разделе «Уточнить маску» выберите «Удалить объекты по краям», а затем разделите маски бактерий, расположенных рядом друг с другом.
   7. Рассчитайте оценки полярности сигнала в канале 488 для каждой ячейки, как это было описано ранее в шагах 1.1.2–1.1.3.
2. Количественная оценка динамики гибридных белков sfGFP (Рисунок 2)
   ЗАМЕТКА: Динамика определяется как изменение интенсивности с течением времени, и следующие шаги предназначены для коротких периодов визуализации (т.е. нескольких минут). Добавьте в прокладку соответствующие добавки, если вы хотите более длительные периоды визуализации.
   1. В окне «Захват изображения » отметьте «Таймлапс», введите время интервалов в поле интервала и введите 2 в поле # в поле «Точки времени ». Получите два последовательных изображения Legionella pneumophila , экспрессирующей интересующий флуоресцентный белок.
   2. Отрегулируйте контрастность изображения до тех пор, пока ячейки не станут четко видны. Следуйте рисунку 2A и приведенным ниже описаниям, чтобы разместить три разные маски. С помощью инструмента «Область» поместите квадрат размером 0,25 x 0,25 мкм в середину не менее 400 ячеек.
   3. Используйте кнопку Область для маски , чтобы создать маску (маску 1) интересующих квадратов. Создайте новую пустую маску (маску 2) и с помощью инструмента «Пиксель» или «Многоугольник» отметьте всю площадь ячейки не менее чем из 25 случайных ячеек, которые будут использоваться для расчета флуоресцентного обесцвечивания. Создайте новую пустую маску (маска 3) и с помощью инструмента «Большая кисть» выделите области между ячейками, которые будут использоваться для вычитания фона.
   4. В разделах «Статистика маски » и «Область маски» выберите «Объект » для масок 1 и 2. Затем в разделе «Объекты и интенсивность» выберите «Средняя интенсивность » и экспортируйте данные двух масок. Для маски 3 экспортируйте среднюю интенсивность всей маски.
   5. Рассчитаем изменение интенсивности флуоресценции для каждого объекта в маске 1 по следующим формулам:

где маска 1 представляет собой квадрат размером 0,25 мкм × 0,25 мкм, расположенный в центре ячейки, маска 2 охватывает всю клетку, маска 3 представляет собой фон между клетками, t1 — средняя интенсивность в первой временной точке, а t2 — средняя интенсивность во второй временной точке.

Результаты

Рисунок 1: Количественная оценка полярной локализации субъединиц системы Dot/Icm. (A) Визуализация DotB-sfGFP в реальном времени, выраженная в Lp01 , показала полярную локализацию. DotB-sfGFP демонстрировал диффузный ...

Материалы