В видеоролике рассказывается о том, как подготовить образцы Legionella pneumophila к криоэлектронной томографии, сочетая методы бактериальной культуры, маркировки наночастицами золота и методов витрификации. Этот процесс сохраняет нативные клеточные структуры и позволяет получать изображения компонентов мембраноассоциированной системы секреции с высоким разрешением.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка Legionella pneumophila к криогенной электронной томографии
375 просмотров
⸱
30 октября 2025 г.
В этой статье
Аннотация
Протокол
1. Определение плотности массы sfGFP с помощью Cryo-ET
1. Пробоподготовка, сбор и реконструкция
1. Вырастите толстый участок Legionella pneumophila , экспрессирующий флуоресцентно меченный белок Dot/Icm на пластинах CYE-агара-стрептомицина в течение 48 часов при 37 °C. Ресуспендируйте клетки в ddH2O до OD600 0,7. Добавьте 5 мкл частиц коллоидного золота (BSA Tracer, 10 нм) в 20 мкл клеточной суспензии.
2. Нанесите пипеткой 5 μL клеточной смеси на только что разряженную дырчатую угольную решетку (R 2/1 на Cu 200 меш) и дайте постоять 1 минуту. Промокните фильтровальной бумагой и заморозьте в жидком этане с помощью плунжерного аппарата с гравитационным приводом.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Частицы коллоидного золота 10 нм | Аурион | 25486 | |
| В 100 раз больше цели по плану Апо (1,4 NA) | Компания Nikon | ||
| ТУЗОВ | Сигма-Олдрич | А9758 | |
| Цифровая монохромная камера CoolSNAP EZ 20 МГц | Фотометрия | ||
| Каркас гена, 1,7x2,8 см, 125 μл | Научный центр Фишера | АБ-0578 | |
| Holey Карбоновая сетка R 2/1 Cu 200 меш | Квантифойл | В225-CR1 | |
| Нонагидрат нитрата железа (III) | Сигма-Олдрич | 216828 | |
| Фотоаппарат K2 Summit для крио-ЭМ | ГАТАН | ||
| Предметные стекла крышки микроскопа 22х22 мм | Научный центр Фишера | 12-542В | |
| Предметные стекла для крышки микроскопа 24x50 мм | Научный центр Фишера | 12-545К | |
| Предметные стекла для микроскопа 25х75х1 мм | Глобус Сайнтиш | 1380 | |
| Слайдбук 6.0 | Интеллектуальные инновации в области визуализации | ||
| Световой модуль Spectra X | Люменкор |
Теги
