Культивирование быстрорастущей бактерии Vibrio natriegens

Аннотация

Источник: Виганд, Д. Дж., Ли и др., Экспрессия бесклеточного белка с использованием быстро растущей бактерии Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео показано выращивание и сбор Vibrio natriegens, быстрорастущей бактерии, в условиях аэрации для приготовления бактериальных гранул для производства сырого экстракта.

Протокол

Приготовление экстракта сырых клеток Vibrio natriegens – бактериальной культуры

1. Приготовьте бактериальную питательную среду V. natriegens LB-V2 (бульон лизогении с солями V2) в соответствии с таблицей 1. Простерилизуйте питательную среду путем автоклавирования. Дайте фильтрующему материалу нагреться до комнатной температуры (RT). Храните излишки медиа в RT.
   ОСТОРОЖНОСТЬ: При работе с автоклавом надевайте надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) и обращайтесь к инструкциям лаборатории.
2. Используйте глицериновый запас V. natriegens дикого типа для инокуляции 3 мл среды LB-V2. Выращивайте в течение ночи при температуре 30 °C и встряхивайте при 225 об/мин.
3. Промойте 1 мл ночной культуры центрифугированием при 10 600 x g на настольной центрифуге в течение 1 минуты. Отсадите надосадочную жидкость, не нарушая полученную гранулу, и повторно суспендируйте в 1 мл свежей среды LB-V2.
4. В автоклавную колбу Эрленмейера объемом 4 л со стерильной крышкой добавьте 1 л свежей питательной среды LB-V2. Инокулируйте с использованием 1 мл промытой на ночь культуры (коэффициент разбавления 1:1 000). Выращивайте культуру при 30 °C, встряхивая при 225 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Культуры V. natriegens можно увеличивать или уменьшать с сохранением коэффициента разведения 1:1000. Например, добавьте 250 мкл промытой на ночь культуры к 250 мл свежей питательной среды LB-V2 в колбу Эрленмейера объемом 2 л со стерильной крышкой.
5. Контролируйте наружный диаметр_{культуры 600} с помощью спектрофотометра. Когда наружный диаметр культуры достигнет₆₀₀ = 1,0 ± 0,2, соберите культуру с помощью центрифугирования при 3 500 x g в течение 20 минут при 4 °C. Поместите гранулу на лед.
   ПРИМЕЧАНИЕ: V. natriegens быстро разрастается, поэтому необходим тщательный контроль за культурой. Рост до OD₆₀₀ = 1,0 должен занять примерно 1,5−2 ч при коэффициенте разбавления 1:1000.
6. Отсадите надосадочную жидкость и немедленно храните полученную бактериальную гранулу при температуре -80 °C или непосредственно приступайте к лизису клеток.
   ЗАМЕТКА: Этот шаг является хорошей точкой остановки; Тем не менее, для достижения наилучших результатов рекомендуется обрабатывать гранулы сразу или в течение 1−2 дней.

Таблица 1: Реагенты для приготовления 1 л бактериальной питательной среды LB-V2

Таблица 1 А	Приготовление бактериальной питательной среды LB-V2
Компонент	Количество (г)	Конечная концентрация (мМ)	Итоговый объем (л)
LB Бульон (Миллер)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
KCl	0.31	4.2
Таблица 1 В	Приготовление буфера для лизиса S30A
Компонент	Количество (г)	Конечная концентрация (мМ)	Итоговый объем (л)
Раствор триса (pH 8,0) - 1 м (мл)	25	50	0.5
Mg-глутамат	2.72	14
К-глутамат	6.10	60
Дитиотреитол (DTT) - 1 М (мл)	1	2

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2 мл пробирок	Эппендорф	22363352
ГЕПЕС (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтансульфоновая кислота)	Сигма	Н3375
LB (Лурия-Бертани) Бульон (Миллер)	Сигма	Л3522
Хлорид магния (MgCl₂)	Сигма	М8266
Хлорид калия (KCl)	Сигма	П9333
Хлорид натрия (NaCl)	Сигма	С7653
Раствор триса (pH 8,0) - 1 м	Инвитроген	АМ9856
Vibrio natriegens (Wild-type) Лиофилизированный подвой	АТКС	14048