Приготовление сырого клеточного экстракта из Vibrio natriegens

Аннотация

Источник: Wiegand, D.J., et al. Экспрессия внеклеточного белка с помощью быстрорастущей бактерии Vibrio natriegens. J. vis. Exp. (2019).

В этом видео демонстрируется приготовление клеточного экстракта из Vibrio natriegens, быстро растущей бактерии, известной своей высокой скоростью синтеза белка. Бактериальная гранула промывается и ресуспендируется в буфере для лизиса перед ультразвуком на льду для предотвращения клеточной деградации. Лизат центрифугируется для отделения нерастворимого клеточного мусора, а клеточный экстракт собирают, замораживают и хранят для использования в будущем.

Протокол

1. Получение экстрактов сырых клеток V. natriegens – бактериальная культура

1. Приготовьте бактериальную питательную среду V. natriegens , лизогенный бульон версии 2 (LB-V2) в соответствии с таблицей 1. Простерилизуйте питательную среду путем автоклавирования. Дайте фильтрующему материалу нагреться до комнатной температуры (RT). Храните излишки медиа в RT.
   ОСТОРОЖНОСТЬ: При работе с автоклавом надевайте надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) и обращайтесь к инструкциям лаборатории.
2. Используйте глицериновый запас V. natriegens дикого типа для инокуляции 3 мл среды LB-V2. Выращивайте в течение ночи при температуре 30 °C и встряхивайте при 225 об/мин.
3. Промойте 1 мл ночной культуры центрифугированием при 10 600 x g на настольной центрифуге в течение 1 минуты. Отсадите надосадочную жидкость, не нарушая полученную гранулу, и повторно суспендируйте в 1 мл свежей среды LB-V2.
4. В автоклавную колбу Эрленмейера объемом 4 л со стерильной крышкой добавьте 1 л свежей питательной среды LB-V2. Инокулируйте с использованием 1 мл промытой на ночь культуры (коэффициент разбавления 1:1 000). Выращивайте культуру при 30 °C, встряхивая при 225 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Культуры V. natriegens можно увеличивать или уменьшать с сохранением коэффициента разведения 1:1000. Например, добавьте 250 мкл промытой на ночь культуры к 250 мл свежей питательной среды LB-V2 в колбу Эрленмейера объемом 2 л со стерильной крышкой.
5. Контролируйте наружный диаметр_{культуры 600} с помощью спектрофотометра. Когда наружный диаметр культуры достигнет₆₀₀ = 1,0 ± 0,2, соберите культуру центрифугированием при 3 500 x g в течение 20 минут при 4 °C. Поместите гранулу на лед.
   ПРИМЕЧАНИЕ: V. natriegens быстро разрастается, поэтому необходим тщательный контроль за культурой. Рост до OD₆₀₀ = 1,0 должен занять примерно 1,5−2 ч при коэффициенте разбавления 1:1000.
6. Отсадите надосадочную жидкость и немедленно храните полученную бактериальную гранулу при температуре -80 °C или непосредственно приступайте к лизису клеток, описанному в разделе 2.
   ЗАМЕТКА: Этот шаг является хорошей точкой остановки; Тем не менее, для достижения наилучших результатов рекомендуется обрабатывать гранулы сразу или в течение 1−2 дней.

2. Получение экстрактов сырых клеток V. natriegens – лизис клеток

1. Приготовьте буфер для лизиса S30 в соответствии с таблицей 1 в стерильной деионизированной (DI) воде и отрегулируйте pH до 7,7 с помощью ледяной уксусной кислоты.
   ОСТОРОЖНОСТЬ: При регулировке pH с ледяной уксусной кислотой следует обращаться с надлежащими СИЗ.
2. Охладите буфер для лизиса S30 примерно до 4 °C в холодильнике или на льду перед началом процедуры лизиса клеток.
   ЗАМЕТКА: Для быстрого охлаждения буфер для лизиса можно поместить при температуре -20 °C. Не допускайте замерзания буфера.
3. Поместите клеточные гранулы на лед на 10−20 мин или до полного оттаивания. Повторно суспендируйте все гранулы, полученные из той же 1 л культуры, используя 10 мл холодного буфера для лизиса S30, затем перенесите суспензию в пробирку объемом 50 мл. Если пеллеты не были заморожены в морозильной камере при температуре -80 °C на шаге 1.6, приступайте непосредственно к ресуспензии.
   ЗАМЕТКА: При необходимости увеличивайте объем буфера для лизиса S30, используемого для первоначального ресуспендирования гранул.
4. Центрифугируйте суспензию при 3 500 x g в течение 10 мин при 4 °C. Отсаживайте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. Промойте гранулу второй раз, используя 10 мл холодного буфера для лизиса S30. Выложите лепешку на лед.
5. В холодном помещении добавьте 500 мкл холодного буфера для лизиса S30 в гранулу в пробирке объемом 50 мл. С помощью наконечника пипетки с широким отверстием суспензируйте гранулу и осторожно перенесите всю суспензию гранул в пробирку объемом 2 мл.
   ЗАМЕТКА: Если пипетка с широким проходом недоступна, с помощью ножниц отрежьте конец наконечника пипетки объемом 1 мл, чтобы увеличить отверстие для переноса гранул.
   1. Переложите как можно больше гранул без значительного увеличения объема; однако гранулу следует повторно суспендировать в жидкости, достаточной для обработки ультразвуком, на что указывает однородная суспензия в пробирке объемом 2 мл. Не переполняйте пробирку объемом 2 мл. Суспензия не должна превышать 1,5 мл; При необходимости разделите на несколько пробирок.
6. Держите клеточную гранулу на льду и работайте в холодном помещении. Наполните стакан объемом 600 мл льдом и положите на лед держатель пробирки объемом 2 мл.
   ЗАМЕТКА: Полезно разместить держатель трубки рядом с боковой стороной стакана, чтобы суспензия гранул была видна во льду для отслеживания хода ультразвуковой обработки (см. Рисунок 1).
7. Вортексируйте гранулу в пробирке объемом 2 мл на короткое время, чтобы гомогенизировать клетки, переверните пробирки, чтобы удалить все клетки на нижней части крышки, и поместите в держатель пробирки с открытой крышкой. Опустите наконечник ультразвуковой аппарата в суспензию так, чтобы он оказался прямо под поверхностью жидкости.
8. Подготовьте установку для ультразвуковой обработки, как показано на рисунке 2 , с помощью ультразвукового аппарата и зонда с диаметром кончика 1/8 дюйма. Введите в управление ультразвуковым аппаратом следующие настройки: частота 20 кГц и амплитуда 50%, время включения импульса: 10 с, время выключения импульса: 60 с.
9. Запустите протокол пульсовой ультразвука в течение трех циклов. Если общий объем суспензии гранул составляет > 500 мкл, выполните протокол ультразвуковой обработки импульса шесть раз.
   ЗАМЕТКА: Как правило, для лизирования гранул V. natriegens достаточно 3−6 импульсов; В зависимости от ультразвукового аппарата могут потребоваться дополнительные импульсы. Во время ультразвуковой обработки используйте платформу с помощью регулировочной ручки, чтобы перемещать зонд вверх и вниз, чтобы лизировать любые гранулы, которые могли оседать на дно пробирки. Трубку можно извлечь из держателя и кратковременно сделать вихревой для повторной гомогенизации суспензии между импульсами.
   ОСТОРОЖНОСТЬ: Надевайте соответствующие средства защиты органов слуха, когда ультразвуковое аппарат активно.
10. После обработки ультразвуком центрифугируют экстракт сырых клеток при давлении 16000 x g в течение 30-45 мин при 4°C или до тех пор, пока лизат не освободится от какого-либо клеточного мусора, как показано на рисунке 3.
11. В холодном помещении аквотировать 50 мкл полученной надосадочной жидкости в новые 2 мл пробирки, не нарушая пеллеты.
    ЗАМЕТКА: Любой мусор, который случайно попадет в новые 2 мл пробирки, резко снизит способность экстракта к высокопродуктивному синтезу белка.
12. Мгновенная заморозка неочищенных клеточных экстрактов путем помещения пробирок в держатель пробирки с прикрепленной веревкой для погружения, как показано на рисунке 4. Погрузите пробирки в сосуд Дьюара, содержащий жидкий азот, и немедленно поместите их в морозильную камеру при температуре -80 °C до использования. ОСТОРОЖНОСТЬ: Используйте соответствующие СИЗ для работы с жидким азотом, включая лабораторный халат, защитные очки, защитный щиток для лица, криогенный фартук и перчатки.

Таблица 1: Реагенты для приготовления 1 л бактериальной питательной среды LB-V2 и 0,5 л буфера для лизиса клеток S30A.

Таблица 1 А	Приготовление бактериальной питательной среды LB-V2
Компонент	Количество (г)	Конечная концентрация (мМ)	Итоговый объем (л)
LB Бульон (Миллер)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
KCl	0.31	4.2
Таблица 1 В	Приготовление буфера для лизиса S30A
Компонент	Количество (г)	Конечная концентрация (мМ)	Итоговый объем (л)
Раствор триса (pH 8,0) - 1 м (мл)*	25	50	0.5
Mg-глутамат	2.72	14
К-глутамат	6.10	60
Дитиотреитол (DTT) - 1 М (мл)*	1	2

Результаты

Рисунок 1: Крупный план стакана и держателя трубки на платформе для ультразвуковой обработки.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пробирки 15 мл	Корнинг	352196
2 мл пробирок	Эппендорф	22363352
Пробирки 50 мл	Корнинг	352070
Фляга Дьюара - 4 л	ТермоСайентиал	10-194-100С
L-глутаминовая кислота гемимагния соль тетрагидрат	Сигма	49605
L-глутаминовая кислота моногидрат соли калия	Сигма	Г1149
LB Бульон (Миллер)	Сигма	Л3522
Хлорид магния (MgCl₂)	Сигма	М8266
Хлорид калия (KCl)	Сигма	П9333
Гранулы гидроксида калия	Сигма/Рош	1050121000
Ультразвуковой аппарат Q125 и зонд CL-18	Qsonica	4422
Хлорид натрия (NaCl)	Сигма	С7653
Vibrio natriegens (Wild-type) Лиофилизированный подвой	АТКС	14048